ATRA對肝癌細胞HepG2生物學行為的影響

周 青，魏 翔，張素梅，汪 淵

目前世界每年新增加的癌癥患者約1 808萬，死亡約956萬[1]，在未來相當長的時間癌癥仍將是人類面臨的一項嚴峻挑戰(zhàn)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的進步人們對癌癥的本質有了深入的了解，腫瘤的治療也由傳統(tǒng)的手術、放療和化療發(fā)展到多學科聯(lián)合治療，并出現(xiàn)了誘導分化治療。誘導分化治療是指誘導分化劑作用于腫瘤細胞后腫瘤細胞重新向正常細胞分化，生物學特性逐漸向正常細胞靠攏，甚至轉變成正常細胞的現(xiàn)象。維甲酸類化合物是典型的誘導分化劑且在臨床廣泛使用，它包括全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)、3,4-雙脫氫維甲酸(ddRA)、9-順維甲酸(9-cis-RA)和13-順維甲酸(13-cis-RA)等[2]。研究[3]表明ATRA對多種腫瘤細胞具有誘導分化、抑制增殖并促進凋亡的作用，本文主要研究ATRA作為體外誘導分化劑對人肝癌細胞株HepG2在分化、凋亡、遷移和克隆形成等細胞生物學行為方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人肝癌細胞株HepG2(安徽醫(yī)科大學分子生物學實驗室保存)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Clark公司)；ATRA和MTT試劑(美國Sigma公司)；細胞凋亡Hoechst 33258試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；γ-GT、AFP檢測試劑盒(上海復興長征醫(yī)學科學有限公司)等。

1.2 主要實驗儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機和酶標儀(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)；熒光顯微鏡DM400B和倒置顯微鏡DMI3000B(德國Leica公司)；超聲破碎儀(寧波新芝公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞的復蘇和培養(yǎng) 將保存的HepG2細胞從液氮中取出，37 ℃水浴融化，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，混勻。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d傳代后使用。

1.3.2細胞形態(tài)的觀察和AFP、γ-GT比活性的檢測 將HepG2細胞分為對照組(含0.1%的DMSO)和ATRA加藥組(ATRA溶解于DMSO中，ATRA終濃度分別為1 μmol/L和10 μmol/L)，預實驗表明0.1%DMSO對細胞生長沒有影響。待細胞密度達到80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調整細胞密度為6×103個/ml，細胞按2、5、14、42、72 d時間培養(yǎng)，2、5 d加藥組直接在24孔板中培養(yǎng)，14、42、72 d加藥組先在培養(yǎng)瓶中加藥培養(yǎng)，3 d傳代1次，最后5 d移至24孔板中培養(yǎng)(調整細胞密度為6×103個/ml)。到達預定培養(yǎng)時間后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化并拍照；收集對照組和加藥組細胞，離心取上清液檢測AFP含量；將細胞沉淀用PBS洗滌3次，加入含0.5%Triton X-100的Tris-HCl緩沖液，超聲破碎，4 ℃高速離心15 min(15 000 r/min)，取上清液用BCA法蛋白定量后檢測γ-GT比活性。

1.3.3細胞增殖實驗 細胞分組、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間同上；取200 μl細胞密度為5×103個/ml的DMEM完全培養(yǎng)基加入96孔板中，每組6個復孔，在到達培養(yǎng)時間時，每孔加入10 μl MTT(5 g/L)，置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡孔中培養(yǎng)基, 每孔加入100 μl DMSO，酶標儀檢測對照組和加藥組吸光度A，細胞抑制率%=(細胞對照組OD570-加藥處理組OD570)/細胞對照組OD570×100%，重復3次，計算各組細胞抑制率。

1.3.4細胞凋亡實驗 將硅化蓋玻片放入清潔液中浸泡，流水沖洗，再用去離子水沖洗，高壓滅菌后置于70%乙醇中浸泡，使用時超凈臺中吹干放入24孔板中，種入細胞；細胞分組、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間同上，各組細胞在密度達到50%～60%時取出蓋玻片放在載玻片上固定并Hoechst染色。熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)，細胞核致密濃染為凋亡細胞。每一組細胞隨機拍攝3個視野，細胞計數(shù)。重復3次，計算細胞凋亡率，凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.5細胞遷移實驗 取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后接種至24孔板中。待細胞全部長滿24孔板底部，用200 μl塑料吸頭在24孔板每孔中央劃出一條直線劃痕，洗去脫落細胞，在顯微鏡下拍照作為0 h，對照組和加藥組培養(yǎng)至24、48、72 h時，分別在同一觀察點拍照記錄細胞劃痕處的細胞遷移情況，重復3次。利用Quantity One軟件測量各孔多點劃痕距離取均值，細胞遷移距離為0 h的距離減去24、48、72 h處理后的距離。

1.3.6細胞軟瓊脂克隆實驗 首先在6孔細胞培養(yǎng)板中鋪設0.6%瓊脂(每孔3 ml)，冷卻凝固作為底層瓊脂；取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，制備成單細胞懸液并稀釋到終濃度為1×103個/ml；鋪設0.3%上層軟瓊脂，按1 ∶1比例吸取2×DMEM培養(yǎng)基，加入0.6%軟瓊脂(70 ℃)，迅速混勻再加入細胞懸液(細胞終濃度5×102個/ml)，輕輕混勻，按每孔1.0 ml加入6孔板中，6孔板置于濕盒中室溫放置30 min，再連同濕盒一起置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在到達各培養(yǎng)時間時每孔加入MTT染液1 ml，30 min后觀察對照組和加藥組細胞克隆的形成狀態(tài)并拍照。

2 結果

2.1 ATRA對HepG2細胞分化的影響

2.1.1HepG2細胞形態(tài)學的變化 倒置顯微鏡下觀察到HepG2對照組細胞成簇狀生長，細胞密度大，具有良好的光澤度，細胞形態(tài)不因培養(yǎng)時間不同而發(fā)生變化(圖1)。1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細胞在第5天時可見細胞數(shù)目減少且細胞形態(tài)不規(guī)則并呈離散狀生長，72 d時細胞形態(tài)更為細長，多核細胞更少；同一處理時間段10 μmol/L ATRA組細胞形態(tài)變化比1 μmol/L ATRA組更加明顯。

2.1.2ATRA對HepG2細胞γ-GT比活性和AFP分泌量的影響 與對照組相比，同一處理天數(shù)，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細胞γ-GT比活性均呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義。與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組AFP分泌量也呈下降趨勢，但處理時間較短時差異無統(tǒng)計學意義；與對照組相比，1 μmol/L ATRA組從第42天起AFP值的差異有統(tǒng)計學意義，10 μmol/L ATRA組從第14天起差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 ATRA對HepG2細胞凋亡的影響在熒光顯微鏡下可以觀察到對照組的HepG2細胞核發(fā)出均勻的藍色熒光(圖2)，而1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組可見核致密濃染的凋亡細胞(箭頭處為凋亡小體)，在第72天10 μmol/L ATRA組凋亡小體最多。統(tǒng)計顯示自第5天起1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

2.3 ATRA對HepG2細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組從第2天開始生長受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義；10 μmol/L ATRA組較1 μmol/L ATRA組對HepG2細胞的抑制程度更高(表3)。

2.4 ATRA對HepG2細胞遷移的影響對照組24 h遷移距離為(7.31±3.20) μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組24 h遷移距離分別為(12.28±1.97)μm和(10.50±3.12)μm；48 h對照組遷移距離為(40.03±4.68)μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組遷移距離分別為(36.15±4.72)μm和(27.41±2.49)μm; 72 h對照組遷移距離為(50.36±3.14)μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組遷移距離分別為(45.76±4.35)μm和(29.63±2.40)μm。統(tǒng)計學分析結果顯示，加藥組24、48、72 h細胞劃痕間傷口愈合距離均低于同期對照組(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義，10 μmol/L ATRA比1 μmol/L ATRA作用更強。

圖1 ATRA誘導HepG2分化在細胞形態(tài)學上的影響 ×100

表1 ATRA處理肝癌細胞HepG2細胞后 γ-GT的比活性和AFP的分泌量

與對照組比較：*P<0.05

2.5 ATRA對HepG2細胞克隆形成能力的影響軟瓊脂克隆形成實驗表明HepG2細胞可以在軟瓊脂上形成克隆，與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組克隆數(shù)目減少，到72 d時1 μmol/L ATRA組仍可見少量克隆，但10 μmol/L ATRA組基本無克隆生長。提示HepG2細胞受到ATRA刺激后能明顯抑制HepG2腫瘤細胞在軟瓊脂中的克隆形成(圖4)。

圖2 ATRA對肝癌細胞HepG2凋亡的影響 ×200

表2 ATRA對肝癌細胞HepG2凋亡的影響

與對照組比較：*P<0.05

3 討論

誘導分化劑治療惡性腫瘤的理論基礎是誘導分化劑可以使腫瘤細胞的分化潛能部分或全部恢復進而轉化為正常細胞，或誘導腫瘤細胞凋亡從而達到治療腫瘤的目的[4]。ATRA目前在臨床上常被用于急性早幼粒白血病的誘導分化治療[5]。本研究初步探討ATRA作用于人肝癌細胞株HepG2后，HepG2細胞分化、凋亡、遷移和克隆形成等生物學行為的變化。

本研究選擇γ-GT和AFP作為ATRA誘導HepG2細胞分化的觀察指標。正常血清中γ-GT主要來自肝臟，當肝細胞發(fā)生癌變時活性逐漸上升且與惡變程度正相關，因此可以把γ-GT作為肝癌診斷的標志物[6]。AFP主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成，正常成人無分泌，且分泌量與肝癌的惡性程度密切相關，AFP是肝癌特異性標志物[7]，本研究選擇這兩個指標作為觀察HepG2細胞分化的指標。

表3 ATRA對肝癌細胞HepG2增殖的影響(n=6)

與對照組比較：*P<0.05

首先觀察了1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA藥物處理組對HepG2細胞分化的影響，結果顯示對照組HepG2成簇狀生長，細胞密度大，具有良好的光澤度，細胞形態(tài)不隨培養(yǎng)時間長短發(fā)生改變，經(jīng)過ATRA處理后HepG2細胞生長離散，細胞數(shù)目減少，細胞核變小且發(fā)生凹陷和分葉，胞質增多，并隨著作用時間的延長形態(tài)學改變越明顯，與Arisi et al[8]的研究中細胞形態(tài)學改變一致。結果分析顯示：同一處理時間段1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組的γ-GT比活性和AFP分泌量均低于對照組；組內不同處理時間段之間γ-GT比活性和AFP分泌量也有差異。ATRA加藥組在誘導HepG2細胞分化過程中隨處理時間的增加γ-GT比活性和AFP分泌量呈下低趨勢，表明ATRA處理的HepG2細胞惡性程度降低[9]。提示1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA具有誘導HepG2分化的作用。

圖3 ATRA對肝癌細胞HepG2遷移的影響×100

A：細胞劃痕實驗圖；B：細胞劃痕實驗柱狀統(tǒng)計圖；與24 h對照組比較：*P<0.05；與48 h對照組比較：#P<0.05；與 72 h對照組比較：△P<0.05

圖4 ATRA對肝癌細胞HepG2克隆形成能力的影響

MTT試驗結果表明，ATRA能夠抑制HepG2細胞的增殖，與對照組比較，ATRA加藥組細胞均自2 d時開始受到抑制，細胞抑制率隨處理時間的增加而增加，72 d時細胞抑制率最高達到59.043%。Hoechst染色結果顯示細胞對照組在熒光顯微鏡下細胞核發(fā)出均勻的藍色熒光，偶見凋亡細胞，而加藥組可見致密濃染的凋亡細胞、碎裂和凋亡小體。1 μmol/L ATRA處理72 d后，HepG2細胞凋亡率(6.244±1.462)%，10 μmol/L ATRA處理72 d后凋亡率為(9.458±2.246)%。說明ATRA不僅可以促進HepG2細胞向正常細胞再分化、抑制HepG2細胞增殖還可以誘導HepG2細胞凋亡[10]。

根據(jù)劃痕實驗結果可以初步研究腫瘤細胞的遷移能力，通過判斷細胞對照組與加藥組劃痕的愈合距離來判斷細胞的遷移能力強弱[11]。實驗中觀察到在低濃度血清培養(yǎng)基中，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細胞劃痕間傷口愈合距離在24、48、72 h均低于對照組；提示ATRA具有抑制HepG2細胞的遷移能力，且隨著藥物濃度的增加其抑制遷移的作用也隨之增強。

HepG2細胞對照組在軟瓊脂上形成較多的克隆，ATRA刺激后HepG2細胞在軟瓊脂中的克隆形成減少，72 d后10 μmol/L ATRA組幾乎無克隆形成，但1 μmol/L ATRA組仍可見少量克隆。提示ATRA能夠抑制HepG2細胞在體外克隆形成能力且ATRA對HepG2克隆能力的抑制程度呈時間與劑量依賴。