葡萄籽原花青素對(duì)碘海醇所致HK-2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

單微微，翟志紅，丁玉松，王 忠

隨著現(xiàn)今介入診斷及治療的廣泛普及，造影劑(contrast media,CM)的使用日益頻繁。在其應(yīng)用過程中，所發(fā)生的無其它原因的急性腎功能損害稱為造影劑腎病(contrast-induced nephropathy,CIN)，目前顯著增多的CIN已成為醫(yī)源性急性腎損傷的第三大原因[1-2]。人們對(duì)CIN的防治進(jìn)行了大量的研究，并取得了一些進(jìn)展，但在現(xiàn)實(shí)世界中的臨床獲益并不盡人意[3]。鑒于此，尋找更為有效的預(yù)防和治療CIN的藥物顯得意義重大。CIN的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前一致認(rèn)為CM對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的直接毒性和其所致的氧化應(yīng)激是CIN發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制[2,4]。近年來許多研究[5]證實(shí)核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor elytroid 2-related factor，Nrf2)在腎臟疾病的防治中具有重要生理學(xué)作用，激活Nrf2信號(hào)通路能有效提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激和抗損傷能力。目前葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)被認(rèn)為是天然的Nrf2活化劑，其可激活Nrf2信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[6-7]，而GSPE能否通過 Nrf2信號(hào)通路預(yù)防CIN卻未有報(bào)道。該研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察GSPE對(duì)碘海醇所致的HK-2細(xì)胞凋亡損傷的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，以期對(duì)CIN防治的深入研究提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品與試劑HK-2細(xì)胞(上海富衡生物科技有限公司，貨號(hào)：FH0228)；胎牛血清(以色列BI公司，貨號(hào)：BISH0798)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國GIBCO公司，貨號(hào)：8118125)；碘海醇(中國通用電氣有限公司)；GSPE(天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，純度>95.0%，批號(hào)：G050412)；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：AP101)；ROS檢測試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：E004)；CCK-8試劑盒(貨號(hào)：AR1160-500)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(貨號(hào)：BA1054)，兔多抗Nrf2、NQO1、HO-1抗體(貨號(hào)：BA3790、BM4978、BM4010)，兔單抗Keap1、Bcl-2、Bax(貨號(hào)：BA4497-2、PB3217、PB3351)(武漢博士德生物工程有限公司)；兔多抗caspase-3、兔單抗GAPDH(美國CST公司，貨號(hào)：#5174)；鼠單抗β-actin、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：TA-09、ZB-2305)；總RNA抽提試劑TRIzol(美國Ambion，貨號(hào)：15596-026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa，貨號(hào)：RR037A)；QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒(德國QIAGEN，貨號(hào)：Q111-02)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI，型號(hào)：Quant Studio 6)；紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號(hào)：JY02S)。

1.2 檢測指標(biāo)和方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 用DMEM/F12培養(yǎng)基+10%的胎牛血清配成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，在細(xì)胞孵育箱中37 ℃、5%CO2環(huán)境中孵育。生長至亞融合狀態(tài)時(shí)換為無血清培養(yǎng)基同步12 h后根據(jù)分組給予不同處理。實(shí)驗(yàn)分為4組：① 對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)30 h；② 碘海醇組：細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h后+碘海醇(100 mgI/ml作用細(xì)胞6 h)；③ GSPE+碘海醇組：GSPE(15、30、60 μmol/L濃度)與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，加碘海醇(100 mgI/ml)作用6 h；④ GSPE組：GSPE(15、30、60 μmol/L濃度)與細(xì)胞共培養(yǎng)30 h。

1.2.2細(xì)胞增殖/毒性檢測法(CCK-8)測定細(xì)胞活力 細(xì)胞均勻接種于96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按以上分組處理細(xì)胞后，吸棄板孔中上清液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)l.5 h，后取含10% CCK-8的培養(yǎng)基100 μl加入沒有細(xì)胞的孔作為陰性對(duì)照。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=[(實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-陰性對(duì)照組A值)]×100%。

1.2.3DCFH-DA熒光結(jié)合流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 細(xì)胞均勻的接種于六孔板，每個(gè)組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按各組要求處理細(xì)胞后把板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液移除。用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。于六孔板中每孔加入稀釋好的DCFH-DA 1 ml，后孵育30 min～1 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板用PBS洗滌細(xì)胞3次，充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。消化細(xì)胞，收集、離心后用PBS洗滌，再用PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4流式Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞均勻接種于六孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，每個(gè)組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長至良好狀態(tài)時(shí)，按以上分組處理細(xì)胞。后用不含EDTA的胰酶消化(操作要輕柔，且盡量少吹打細(xì)胞)、離心。后用PBS洗滌細(xì)胞1次，以盡可能去除殘留的培養(yǎng)基。然后離心，吸棄PBS，再根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法試劑盒說明書進(jìn)行操作，后流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Western blot 法檢測HK-2細(xì)胞Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) 細(xì)胞均勻接種于六孔板，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按各組要求處理細(xì)胞后，把板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液移除，用PBS液輕柔地洗滌細(xì)胞3次。后置于冰上操作，每孔加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液150 μl，裂解20 min，后用刮刀將細(xì)胞刮下，收集、離心，取上清液，測蛋白濃度并配平。每份樣本取等量蛋白加入上樣緩沖液，煮沸10 min變性，凝膠電泳分離，于轉(zhuǎn)膜溶液中將蛋白轉(zhuǎn)移至ECL專用PVDF膜上，室溫下?lián)u動(dòng)封閉2 h，一抗4 ℃ 孵育過夜，后洗去多余一抗，二抗室溫下孵育l～2 h，然后洗去多余二抗。顯色曝光，分別以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參并作相對(duì)量分析。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞均勻接種于六孔板中，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按各組要求處理細(xì)胞后，把板內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液移除，用預(yù)冷的PBS輕柔地洗滌細(xì)胞3次。后TRIzol法提取HK-2細(xì)胞內(nèi)總RNA，后用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)Nrf2、HO-1、NQO1基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所用引物序列見表1。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)。用相對(duì)定量分析公式2-△△Ct，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比，碘海醇組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。與碘海醇組相比，GSPE+碘海醇組細(xì)胞存活率呈GSPE劑量依賴性升高，見表2。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比，碘海醇組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。與碘海醇組相比，GSPE+碘海醇組細(xì)胞凋亡率呈GSPE劑量依賴性降低，見圖1、表3。

2.3 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組比較，碘海醇組ROS水平顯著升高(P<0.01)。與碘海醇組比較，GSPE+碘海醇組細(xì)胞ROS水平呈GSPE劑量依賴性降低，見表3。

2.4 HK-2細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比，碘海醇組Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)量有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；凋亡相關(guān)蛋白 Bax 、Caspase-3的表達(dá)量增加，Bcl-2的表達(dá)量減少(P<0.05)。與對(duì)照組及碘海醇組相比，GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組和GSPE(60 μmol/L)組Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)量均顯著增加(P<0.01)。與碘海醇組相比，GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組的Bcl-2蛋白表達(dá)量增多(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。Keap1的蛋白表達(dá)量各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P>0.05)。見圖2、3。

2.5 HK-2細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比，碘海醇組Nrf2、HO-1 、NQO1mRNA的表達(dá)有所增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而 GSPE干預(yù)后GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組及GSPE(60 μmol/L)組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組和碘海醇組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與碘海醇組比較：#P<0.05

表3 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡率

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與碘海醇組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

A：對(duì)照組；B：碘海醇組；C：GSPE(15 μmol/L)+碘海醇組；D：GSPE(30 μmol/L)+碘海醇組；E：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組；F：GSPE(60 μmol/L)組

表4 HK-2細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，與碘海醇組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

已有的研究表明：CM對(duì)HK-2細(xì)胞具有直接毒性并能加重其氧化應(yīng)激程度，最終引起HK-2細(xì)胞的凋亡、壞死[4,8]。在本實(shí)驗(yàn)中用第二代造影劑碘海醇(100 mgI/ml與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)6 h)[9]干預(yù)體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，同樣觀察到了細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高。細(xì)胞內(nèi)過量ROS的產(chǎn)生可引起并進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡損傷，ROS參與調(diào)控的細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)基因p53所介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)[10]，過量的ROS使p53磷酸化，p53是Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2的上游調(diào)節(jié)基因，當(dāng)磷酸化的p53與Bax基因啟動(dòng)子中p53的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，使Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，這兩種功能互相對(duì)立的蛋白間的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵[11]。Bax的過度表達(dá)還能促進(jìn)線粒體內(nèi)前凋亡分子Cyt-C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，進(jìn)而活化下游的Caspase-3蛋白酶 ，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)中碘海醇使HK-2細(xì)胞內(nèi)Bax和Caspase-3蛋白含量增多，Bcl-2蛋白含量下降，Bcl-2/Bax小于1，因此細(xì)胞凋亡增多。

相比于碘海醇對(duì)HK-2細(xì)胞的不良影響，在本實(shí)驗(yàn)中不同濃度的GSPE皆可拮抗碘海醇所致的細(xì)胞活力降低，抑制碘海醇誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 升高，降低碘海醇所致的細(xì)胞高凋亡率，且在一定劑量范圍內(nèi)具有濃度依賴性。同時(shí)GSPE亦使HK-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白含量增多，Bax和Caspase-3蛋白含量下降，Bcl-2/Bax大于1。說明GSPE對(duì)碘海醇所致的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

圖2 Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

A：對(duì)照組；B：碘海醇組；C：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組；D：GSPE(60 μmol/L)組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與碘海醇組比較：##P<0.01

圖3 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

A：對(duì)照組；B：碘海醇組；C：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇組；D：GSPE(60 μmol/L)組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與碘海醇組比較：#P<0.05，##P<0.01

由于Nrf2信號(hào)通路是機(jī)體主要的抵御外源性刺激和毒物的抗氧化應(yīng)答反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子通路，已經(jīng)明確其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮十分重要的作用。其激活的方式主要是Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)的解偶聯(lián)，Keap1是Nrf2的抑制物，錨定Nrf2于胞漿中處于非活性狀態(tài)而被降解，當(dāng)胞漿中的Keap1與Nrf2解偶聯(lián)，活化的Nrf2才能進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化基因啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)控抗氧化酶、Ⅱ相代謝酶的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化損傷作用[13]。Nrf2與Keap1解偶聯(lián)的發(fā)生主要是Keap1構(gòu)象的改變，由于Keap1蛋白上富含電敏感半胱氨酸結(jié)構(gòu)，在氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)刺激下這些半胱氨酸變異，進(jìn)而導(dǎo)致Keap1構(gòu)象的變化，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，Nrf2的降解減少。在本研究中GSPE提高了HK-2細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因的表達(dá)量和蛋白含量，而不上調(diào)Keap1的蛋白表達(dá)量，說明GSPE有可能導(dǎo)致了Keap1構(gòu)象的變化而激活其調(diào)控通路。

細(xì)胞抗氧化損傷作用的發(fā)揮，胞內(nèi)ROS的降低與Nrf2調(diào)節(jié)的下游Ⅱ相代謝酶NQO1、抗氧化酶HO-1的表達(dá)密切相關(guān)，它們可通過催化醌、氮氧化合物等的雙電子還原來減輕氧化損傷。Jena et al[14]發(fā)現(xiàn)蝦青素能增加HO-1和NQO1的表達(dá)量，明顯降低環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激。黃存東 等[15]研究表明激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，GSPE干預(yù)組與對(duì)照組和碘海醇組相比NQO1和HO-1 基因表達(dá)和蛋白的含量均顯著增高，這表明GSPE能通過激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)了其靶基因表達(dá)，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)不良刺激的抗性。

綜上，GSPE對(duì)碘海醇所致的HK-2細(xì)胞的凋亡損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能是通過激活Nrf2信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。GSPE作為一種純天然物質(zhì)有很大的開發(fā)應(yīng)用前景，基于該研究，在未來GSPE可能用于CIN的預(yù)防和治療。