熱敏灸對慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃腸激素的影響 *

★ 李琳慧 付勇 洪恩四 熊俊 章海鳳**

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是以胃黏膜上皮和腺體萎縮、數(shù)目減少或消失，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病。伴有幽門腺化生和腸腺化生，或不典型增生者被認(rèn)為是胃癌前病變[1]。在我國，CAG在正常人群中的檢出率呈上升趨勢，2014年由中華醫(yī)學(xué)會消化內(nèi)鏡學(xué)分會牽頭開展的一項橫斷面調(diào)查中顯示CAG患者比例占受檢人群的20%左右[2]。CAG是一種多致病因素性疾病及癌前病變。近年來,多項研究結(jié)果表明該病的發(fā)生發(fā)展與胃腸激素的失調(diào)密切相關(guān)[3-4]。胃腸激素是一組由胃腸黏膜的化學(xué)信使細(xì)胞分泌的，廣泛存在于胃腸道的多肽類物質(zhì)，對胃腸功能、炎癥、腫瘤等具有調(diào)節(jié)作用[5]。CAG患者的胃腸激素水平明顯異于正常人[6]，檢測胃腸激素的水平對評估CAG的嚴(yán)重程度和治療效果具有重要的臨床意義。因此本研究觀察CAG大鼠胃泌素(GAS)、生長抑素(SS)、胃動素(MTL)以及炎癥因子IL-6的變化情況，探討熱敏灸治療CAG的可能效應(yīng)機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級SD雄性大鼠66只，5周齡，體質(zhì)量150～180g(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，SCXK湘：2016-0002)。采用籠養(yǎng)，恒溫(25±2)℃，濕度60%～70%，保持實驗室環(huán)境安靜舒適，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，按隨機數(shù)字表隨機分為空白組12只，造模組54只，第8周開始，造模組每2周抽取2只大鼠送檢觀察造模是否成功，12周后隨機取2只空白組大鼠對比觀察，并根據(jù)胃黏膜組織病理學(xué)檢查確立建模成功(造模期間觀察模型建立8只，造模組死亡4只，進(jìn)入治療期大鼠共54只，空白組10只，造模組44只)。造模組隨機分為模型組11只，維酶素組11只，艾灸組22只。艾灸組根據(jù)每日艾灸過程中尾溫(尾根1/3)波動情況，在治療28d內(nèi)大鼠尾溫波動>1℃為熱敏灸組，尾溫波動≤1℃為非熱敏灸組[7-8]，尾溫在1℃上下波動則不納入觀察對象。其中，治療28d內(nèi)尾溫波動>1℃(熱敏灸組)大鼠11只，尾溫波動≤1℃(非熱敏灸組)大鼠8只，尾溫在1℃上下波動大鼠3只，每組各隨機抽取6只納入最終觀察對象。

1.2 主要試劑與儀器 艾條(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，二級精艾絨，規(guī)格：0.8×12cm)；1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG，東京化成工業(yè)株式會社，NJAII-NH)；維酶素片(樂普恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，20170210)；胃泌素(GAS)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E2NZZCNI)；生長抑素(SS)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，CYM8RRGDYK)；胃動素(MTL)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，R2CGX7XD)；白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，5T84VG82P9)。

電子秤(凱豐集團(tuán)，ACS-30)；紅外電子體溫計(深圳華盛昌機械實業(yè)有限公司，DT-8806S)；數(shù)字式醫(yī)用紅外熱像儀(上海維恩偉業(yè)紅外醫(yī)療器械有限公司，WNⅢ0805)；Leica正置熒光顯微鏡(德國Leica儀器有限公司，DM2000)；石蠟包埋機(德國Leica儀器有限公司，EG1150H)；切片機(德國Leica儀器有限公司，RM2255)；微型高速離心機(美國Labnet公司，C2500-R-230V)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本亞斯旺公司，ICV-450)；全自動酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司，Multiskan MK3)。

1.3 模型建立與評價方法 采用文獻(xiàn)法[9-10]，用蒸餾水配置MNNG為100ug/mL飲用液，錫紙包裹飲水瓶，大鼠自由飲用，每日更換1次。每次按1mL/100g予30%乙醇和2%水楊酸鈉混合液灌胃，3次/周，灌胃前、后禁食水1h。同時輔以饑飽失常方法，即足量喂食1d，禁食1d。模型評價方法：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002)組織病理檢查示：①固有腺體萎縮；②黏膜肌層增厚；③可有腸上皮化生或假幽門腺上皮化生；④固有膜炎癥；⑤可有淋巴濾泡形成。

1.4 治療方法 造模結(jié)束后第1天起，艾灸組艾灸“中脘”穴區(qū)(取穴定位參照《實驗針灸學(xué)》[11])，去除毛發(fā)后將點燃艾條置于大鼠“中脘”穴約3cm處，每次灸40min，灸后按2mL/kg/d予0.9%NaCl灌胃；維酶素組束縛40min后灌服等量維酶素溶液；模型組束縛40min后灌服等量0.9%NaCl，各組均每日1次，共治療28d。治療期間空白組不予以任何刺激。

1.5 艾灸“中脘”穴敏化標(biāo)準(zhǔn) 參照相關(guān)研究建立熱敏灸模型方法制定敏化標(biāo)準(zhǔn)[7-8]：艾灸前后應(yīng)用數(shù)字式醫(yī)用紅外熱像儀分別探測大鼠尾部的紅外線溫?zé)嵝畔ⅲ冕t(yī)用紅外熱像系統(tǒng)V2.1記錄小于0.05℃的溫度變化。40min治療過程中，用紅外電子體溫計每5min精確測量大鼠尾溫(尾根1/3)，28天中每天尾溫均升高>1℃即可判為腧穴熱敏現(xiàn)象。

1.6 觀察指標(biāo)與方法 (1)血清GAS、SS、MTL、1L-6檢測：治療結(jié)束后，10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔麻醉大鼠，腹主動脈采血約5mL，靜置2h，離心15min(3000 r/min)取血清，按照ELISA試劑盒說明操作檢測GAS、SS、MTL、1L-6表達(dá)。

(2)胃黏膜組織病理學(xué)觀察：取胃后沿胃大彎剪開，冰0.9%NaCl沖洗，肉眼觀察胃黏膜并記錄，取胃黏膜組織大小約0.5cm×0.5cm，10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察胃黏膜組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 模型建立情況 造模12周后，光鏡下胃組織檢查示：空白組胃黏膜層和肌層厚度正常，黏膜無充血、水腫，腺體豐富且排列整齊；造模組胃黏膜層變薄、充血明顯，肌層增寬，固有層腺體萎縮甚至消失，且排列稀疏不規(guī)則，部分腺體囊性擴(kuò)張，可見淋巴濾泡和炎癥細(xì)胞，可見異形增生，符合CAG病理診斷，提示造模成功(見圖1)。

注：黑色箭頭示異形增生；四角星號示淋巴濾泡浸潤；五角星號示胃腺囊性擴(kuò)張。

圖1 光鏡下胃黏膜組織病理切片觀察(HE染色×100)

2.2 治療后各組血清GAS、SS、MTL、1L-6比較 由表1可見，與空白組相比，模型組、非熱敏灸組血清GAS表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，但熱敏灸組及維酶素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，熱敏灸組及維酶素組血清GAS表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，非熱敏灸組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與非熱敏灸組相比，熱敏灸組血清GAS表達(dá)升高(P<0.05)，但維酶素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；熱敏灸組血清GAS表達(dá)雖比維酶素組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

與空白組相比，模型組、非熱敏灸組、維酶素組血清SS表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)，但熱敏灸組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，熱敏灸組血清SS表達(dá)升高(P<0.05)，非熱敏灸組、維酶素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與非熱敏灸組相比，熱敏灸組血清SS表達(dá)升高(P<0.05)，但維酶素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；熱敏灸組血清SS表達(dá)雖比維酶素組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

與空白組相比，模型組、非熱敏灸組血清MTL、1L-6表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，熱敏灸組MTL、1L-6兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，維酶素組MTL升高(P<0.05)，1L-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，非熱敏灸、熱敏灸組、維酶素組血清MTL、1L-6表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)；與非熱敏灸組相比，熱敏灸組血清MTL、1L-6表達(dá)降低(P<0.05)，維酶素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與維酶素組相比，熱敏灸組血清MTL、1L-6表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

CAG為胃黏膜發(fā)生淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤的慢性萎縮性炎癥性的病變，相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)中的“胃脘痛”“嘈雜”“痞滿”“納呆”等病。西醫(yī)認(rèn)為胃黏膜血流量降低、黏膜營養(yǎng)因子缺乏及血管活性因子改變等是其發(fā)病發(fā)病主要機制，因此治療上多給予改善胃黏膜及胃腸動力等藥物，然而難以從根本上逆轉(zhuǎn)其病理進(jìn)程。而針灸的多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的整體調(diào)控不但可以控制病情發(fā)生發(fā)展，甚至可以逆轉(zhuǎn)萎縮、腸上皮化生及異型增生[12-13]。因此杜元灝等在效能等級針灸病譜中，將CAG界定為針灸Ⅱ級病譜[14](即以針灸治療為主,可獲得整體好轉(zhuǎn))。

表1 各組治療后血清GAS、SS、MTL、1L-6比較 pg/mL

注：與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與非熱敏灸組比較，5)P<0.05。

胃腸激素是一組廣泛存在于胃腸道的多肽類物質(zhì)，對維持胃腸道黏膜的完整性和調(diào)節(jié)胃酸分泌及胃腸運動等有著重要作用[3-4]。其分泌失調(diào)或受體結(jié)構(gòu)及功能的異常均可導(dǎo)致胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展。胃腸激素種類繁多，其中與CAG關(guān)系密切的有胃泌素(GAS)，生長抑素(SS),胃動素(MTL)等。

GAS、SS主要由胃竇部G、D細(xì)胞分泌，GAS能促進(jìn)胃酸分泌，增加胃泌酸區(qū)黏膜血流量，對胃黏膜有營養(yǎng)和保護(hù)作用[15]。SS則可通過保護(hù)谷胱甘肽還原酶活性以維持胃黏膜內(nèi)非蛋白結(jié)合巰基水平，從而防止脂質(zhì)過氧化，保護(hù)胃黏膜[16]，SS還可抑制胃酸分泌及GAS釋放,二者可組成GAS-SS-胃酸分泌軸，在功能上相互協(xié)調(diào),共同維持胃腸道生理功能[17]。有研究表明CAG大鼠因胃竇部黏膜腺體發(fā)生萎縮，數(shù)量減少從而導(dǎo)致GAS、SS的含量下降[18-19]。本實驗的研究結(jié)果表明模型組的GAS、SS含量均下降，說明CAG大鼠存在血清GAS、SS低表達(dá)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。MTL是一種能夠刺激胃體運動的物質(zhì)，對胃腸動力和胃腸電活動有顯著影響。MTL增高時，一方面胃運動增強，胃壁平滑肌持續(xù)強烈收縮，阻斷了通過胃壁的小血管，使胃黏膜血流量減少，黏膜缺血，從而造成胃黏膜損傷。另一方面MTL增高可使胃幽門口緊閉，造成胃竇、幽門及十二指腸不協(xié)調(diào)運動，從而延緩了胃排空，導(dǎo)致胃內(nèi)容物停留時間過長，加重了胃黏膜炎性反應(yīng)[20]。應(yīng)用熱敏灸治療后,MTL水平明顯降低，且療效優(yōu)于非熱敏灸組，說明降低MTL可能是熱敏灸有效作用的環(huán)節(jié)之一。此外，有研究表明CAG是胃黏膜慢性炎癥的過程，促炎細(xì)胞因子(IL-1β和IL-6)的分泌在CAG的發(fā)展中起重要作用[21]。本研究分析了CAG大鼠血清中IL-6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)艾灸(熱敏灸、非熱敏灸)和維酶素治療均可降低CAG大鼠血清IL-6水平，減輕炎癥程度，其中熱敏灸組又優(yōu)于非熱敏灸組，與維酶素組療效相當(dāng)。

綜上所述，熱敏灸可上調(diào)CAG大鼠GAS及SS的水平，下調(diào)MTL及炎癥因子IL-6的水平，且療效明顯優(yōu)于非熱敏灸組，其作用可能是通過調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌，改善胃黏膜血流量，抑制炎癥因子產(chǎn)生，減輕胃黏膜損傷來實現(xiàn)的。