一測多評法測定枇杷止咳軟膠囊中硫酸嗎啡和磷酸可待因的含量及其應(yīng)用拓展

★ 李晶 陳超 文萍 虞金寶

(江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046)

枇杷止咳軟膠囊經(jīng)由部頒標準第17冊收載的“枇杷止咳膠囊”改變劑型而成，處方由枇杷葉、百部、白前、桑白皮、桔梗、罌粟殼、薄荷腦組成，功能止嗽化痰，用于咳嗽、支氣管炎。罌粟殼為方中主藥，功能斂肺止咳，澀腸定痛。其主要含嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因等生物堿[1]，劉永利等[2-3]在測定不同產(chǎn)地及不同等級罌粟殼生物堿類成分含量研究中發(fā)現(xiàn)，諸多罌粟殼所含的生物堿中以嗎啡和可待因含量較高，該二者對于咳嗽中樞均有明顯的抑制作用，是其鎮(zhèn)咳的有效成分，也是成癮性成分[4-5]。收載于中國藥典2010年版及2015年版一部的罌粟殼藥材僅建立了嗎啡的含量測定方法及限度標準[6-7]。鑒于中藥獨特的多成分、多靶點作用特點，同時考慮到嗎啡和可待因作為國家規(guī)定管制藥品的成癮性和危害性的特殊性質(zhì)，為了更準確地把控產(chǎn)品質(zhì)量，需可待因的含量測定方法的研究。本研究同時考察硫酸嗎啡和磷酸可待因含量的方法學，并且依據(jù)該2種成分內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系，采用一測多評的方法，以硫酸嗎啡為對照，通過相對校正因子計算磷酸可待因的含量。該研究為枇杷止咳軟膠囊的質(zhì)量控制提供了新的評價模式，此外，通過將該一測多評法應(yīng)用于同樣含罌粟殼的強力枇杷露的驗證比較，以期為一測多評法對于同類藥物制劑的拓展應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HP-1100高效液相色譜儀(美國：包括1322A在線脫氣機、G1311A四元梯度泵、G1315B二極管陣列檢測器、HP化學工作站)，CQ-250超聲波清洗器(上海船舶電子設(shè)備研究所)，SimplicityTM型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)，AG-135電子天平(梅特勒--托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料 硫酸嗎啡對照品(含量測定用，批號：171238-200303，中國食品藥品檢定研究院)，磷酸可待因?qū)φ掌?含量測定用，批號：171203-200303，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。枇杷止咳軟膠囊(江西津正藥業(yè)有限公司，0.55g/粒)；強力枇杷露(江西遠東藥業(yè)有限公司，100mL/支)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液 取硫酸嗎啡和磷酸可待因?qū)φ掌犯骷s10mg，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為每1mL含硫酸嗎啡1.015mg、磷酸可待因0.555mg的混合對照品儲備溶液。精密吸取儲備液1mL于25mL容量瓶并加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物適量，研勻，取約1.5g，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲(功率250w，頻率33kHz)處理15min，放冷，以甲醇加至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液15mL加至中性氧化鋁柱(3g，100～200目，內(nèi)徑為1cm)，用100mL甲醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取適量以微孔濾膜(0.45μm)濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液 取枇杷止咳軟膠囊制劑處方中缺罌粟殼的其它藥材按制劑處方比例及工藝制備罌粟殼陰性制劑，并以其依"2.1.2"項下供試品溶液方法制得陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件的選擇 色譜柱：Dikma Diamonsil C18(4.6mm×250mm, 5μm)，流動相：乙腈-水(水相為0.01mol·L-1磷酸氫二鈉和0.005mol·L-1庚烷磺酸鈉水溶液)(25∶75)，流速：1mL·min-1，檢測波長220nm。在此條件下，供試品溶液色譜圖中呈現(xiàn)硫酸嗎啡與磷酸可待因?qū)φ掌废嗤Ａ魰r間的色譜峰，且與其它相鄰色譜峰均能獲得分離度大于2.0的較好分離，同時測定陰性供試品溶液未出現(xiàn)干擾此二種成分的色譜峰，見圖1。

圖1 對照品-供試品-陰性HPLC圖

2.3 線性范圍 取"2.2.1"項下混合對照品儲備溶液分別稀釋至體積為6.25、10、12.5、25、50、100倍量，配制成不同濃度的混合對照品溶液。分別吸取10μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，將樣品濃度與峰面積進行回歸，發(fā)現(xiàn)硫酸嗎啡和磷酸可待因在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 對照品線性關(guān)系(n=2)

2.4 精密度 精密吸取同一混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算硫酸嗎啡和磷酸可待因峰面積值RSD分別為1.31%和1.12%(n=6)。表明儀器性能穩(wěn)定。

2.5 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液10μL，于0、1、2、4、8、12、24h分別測定，結(jié)果供試品中硫酸嗎啡和磷酸可待因峰面積的RSD分別為1.48%和1.29%。表明24h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取制劑(批號：20160101)6份，照2.2.2項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，測定并計算硫酸嗎啡和磷酸可待因含量分別為0.2283mg·粒-1和0.0365mg·粒-1，RSD分別為0.96%和2.13%。

2.7 加樣回收率試驗 取本品適量，研細，取約0.75g，共6份，精密稱定，分別置25mL容量瓶中，各精密加入每1mL含0.06215mg硫酸嗎啡和0.01237mg磷酸可待因的混合對照品溶液4mL、5mL、6mL，余按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定并計算回收率，硫酸嗎啡與磷酸可待因平均回收率分別為100.24%和100.62%，RSD分別為1.08%和2.11%，具體如表2。

表2 加樣回收率試驗

2.8 校正因子的確定

2.8.1 相對校正因子(RCF) 以硫酸嗎啡為內(nèi)參物，根據(jù)相對校正因子計算公式[3]，計算磷酸可待因與內(nèi)參物的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表3 待測物質(zhì)RCF結(jié)果(n=2 )

2.8.2 校正因子重現(xiàn)性 為檢驗所確定的RCF對于常規(guī)檢驗的適用性，我們進行了一測多評法校正因子的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價。取2.3項下不同濃度的混合對照品溶液分別進樣測定，通過考察不同色譜儀器、不同型號色譜柱以及改變流動相比例、流速和柱溫對RCF的影響發(fā)現(xiàn)不同條件下已確定的RCF重現(xiàn)性較好，各組平均值結(jié)果為0.849～0.867，RSD均在3%以內(nèi)，表明所建立的一測多評法耐用性良好。

2.8.3 色譜峰定位 色譜峰的定位通?？刹捎孟鄬ΡＡ糁捣╗5]確定，利用硫酸嗎啡的保留時間結(jié)合磷酸可待因的相對保留值及其特征光譜，即可對色譜峰進行定位，通過考察相對保留值在不同品牌色譜儀和色譜柱中的重現(xiàn)性，其中磷酸可待因?qū)α蛩釂岱鹊南鄬ΡＡ魰r間在2.66～2.75，RSD為1.40%。

2.8.3 樣品測定 取枇杷止咳軟膠囊，按2.2.2項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。測定10批樣品中硫酸嗎啡和磷酸可待因含量，結(jié)果如表4，經(jīng)對比外標法實測值與QAMS的計算值，發(fā)現(xiàn)兩種方法含量值之間以Correl相關(guān)系數(shù)計算為0.999006，無顯著性差異，因此通過QAMS進行多指標成分評價枇杷止咳軟膠囊的質(zhì)量方法可行。

表4 外標法與QAMS測定結(jié)果(n=2) mg·粒-1

3 應(yīng)用拓展適用性

鑒于一測多評法是根據(jù)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過僅測定1個易得對照品成分來實現(xiàn)沒有或難以供應(yīng)的多個對照品成分的同步監(jiān)控[5]，我們同時探索了含罌粟殼制劑強力枇杷露中硫酸嗎啡和磷酸可待因的一測多評法適用性，經(jīng)對比驗證10批制劑外標法實測值與QAMS計算值Correl相關(guān)系數(shù)為0.999209，并且相對誤差均小于3.0%，表明該QAMS法同樣適用于強力枇杷露中該2種成分的含量測定。結(jié)果見表5。

表5 外標法與QAMS測定結(jié)果(n=2) mg·mL-1

4 討論

根據(jù)生物堿的酸堿性，在制備供試品溶液時，常采用酸堿處理后用氯仿提取，以除去較多的雜質(zhì)，但由于嗎啡具有兩性酚基結(jié)構(gòu)，能與酸或強堿生成水溶性較大的鹽，且具有較強還原性，易被氧化變質(zhì)，因而使其在任何pH條件下均不能被完全提取[6]。根據(jù)相關(guān)報道[7-8]，實驗中分別采取調(diào)堿后用乙酸乙酯萃取、調(diào)堿后用三氯甲烷萃取、調(diào)堿三氯甲烷萃取后上氧化鋁柱與甲醇提取后直接上氧化鋁柱四種方法制備嗎啡和可待因的供試品溶液。結(jié)果證實，采用后者進樣測定硫酸嗎啡含量約提高兩倍，磷酸可待因含量無明顯差異。

參考文獻[9-12]流動相，分別比較0.05mol·L-1醋酸鈉緩沖液(用冰醋酸調(diào)pH至3.6)-乙腈-甲醇(22∶2∶1), 0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈-甲醇(51∶4∶45)磷酸調(diào)pH至3.0、甲醇-水(水相為0.49%醋酸銨，0.02%三乙胺)(30∶70), 0 .03 mol·L-1醋酸鈉(冰醋酸調(diào)pH 至3 .50)-甲醇(70∶30)，由于在220 nm處甲醇的噪音大且樣品中硫酸嗎啡和磷酸可待因的峰形不好。參照中國藥典(2005版)一部中嗎啡的含量測定方法，我們采用乙腈-水(水相為0.01mol·L-1磷酸氫二鈉和0.005mol·L-1庚烷磺酸鈉水溶液)(25∶75)為流動相進行比較，后者較前者噪音小，且更穩(wěn)定。因此，采用乙腈-水(水相為0.01mol·L-1磷酸氫二鈉和0.005mol·L-1庚烷磺酸鈉水溶液)(25∶75)為流動相。此外還分別對提取方法(振搖和超聲)、提取時間和洗脫溶劑用量等條件進行考察, 結(jié)果表明, 硫酸嗎啡和磷酸可待因以 25mL甲醇超聲提取15min經(jīng)過中性氧化鋁柱以100mL甲醇洗脫效果最好。

相對校正因子確立的重現(xiàn)性實驗中，我們先后考察了RCF在Agilent1100和Shimadzo LC-20AT兩種不同品牌液相色譜儀，三種不同品牌的色譜柱(Dikma Diamonsil C18，Welch C18和Elite Hypersil ODS)，三種不同比例流動相乙腈：水(水相為0.01mol·L-1磷酸氫二鈉和0.005mol·L-1庚烷磺酸鈉水溶液)(24∶76、25∶75、26∶74)，不同流速(0.9、1.0和1.1mL·min-1)以及不同柱溫(25℃、30℃、35℃)條件下進行了分別測定。在一測定多評的應(yīng)用拓展研究中，通過將已定的RCF用于評價強力枇杷露進行驗證，結(jié)果顯示外標法測定值與一測多評法計算值亦無明顯差異，說明在文中線性范圍內(nèi)，基于枇杷止咳軟膠囊建立的一測多評法對強力枇杷露具有通用性和準確性，并推測其可能為其他含罌粟殼制劑一測多評質(zhì)量控制技術(shù)的建立提供借鑒。