過表達(dá)c-SKI對心肌纖維化小鼠的心肌重構(gòu)、心肌纖維化改善作用及其機(jī)制

王娟，向燕，韓素霞

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊830011； 2 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院

研究[1]顯示，缺血性心臟病和心內(nèi)膜心肌纖維化是終末期心力衰竭的主要原因，其中心肌纖維化可導(dǎo)致心肌病理性重構(gòu)、心功能惡化，增加患者死亡風(fēng)險，與疾病預(yù)后密切相關(guān)[2]。既往大量研究[3]證實，TGF-β/Smad信號通路與心血管疾病密切相關(guān)，在心臟收縮功能、血管再生、心肌肥大和纖維化中均有重要的調(diào)控作用。研究[4]顯示，原癌基因c-SKI對TGF-β1/Smad信號通路存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)c-SKI可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和分化，并可抑制胞外基質(zhì)的合成，在離體實驗中證實c-SKI具有抑制心肌纖維化的作用，但是其能否同樣有效改善小鼠心肌纖維化尚未得到進(jìn)一步驗證。2017年1月～2019年12月，本研究利用心肌纖維化小鼠模型，觀察尾靜脈注射c-SKI過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒對心肌纖維化小鼠心室重構(gòu)、心肌組織纖維化的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、動物 c-SKI過表達(dá)的慢病毒重組質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro-SKI購自湖南長沙贏潤生物技術(shù)有限公司。C57雄性小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心提供。

1.2 動物分組、心肌纖維化模型制作及c-SKI慢病毒質(zhì)粒給予方法 將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、模型+c-SKI慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(LV-SKI組)和模型+空白病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(LV-NC組)，每組10只。模型組、LV-SKI組、LV-NC組采用皮下注射異丙腎上腺素(第1天5 mg/kg，第2～30天2.5 mg/kg)的方法構(gòu)建小鼠心肌纖維化模型。LV-SKI組在建模第18天開始每隔3天尾靜脈注射c-SKI過表達(dá)的慢病毒重組質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro-SKI，病毒滴度1×108TU，劑量100 μL，持續(xù)至30天；LV-NC組在建模第18天開始每隔3天尾靜脈注射空白病毒質(zhì)粒，病毒滴度1×108TU，劑量100 uL，持續(xù)至30天；模型組注射等量生理鹽水；對照組不作處理。

1.3 各組小鼠心肌重構(gòu)判斷指標(biāo)觀察

1.3.1 各組小鼠心功能指標(biāo)觀察 取各組小鼠，腹腔注射2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，仰臥位固定，應(yīng)用美國惠普Sonos 5500超聲儀及15 MHz高頻線陣探頭行經(jīng)胸超聲檢查，觀察并記錄心率(HR)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左心室短軸縮短率(FS%)。

1.3.2 各組小鼠心臟重量(HW)、左心室重量(LVM)、心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)測算 取各組小鼠，腹腔注射1～2 mL/kg戊巴比妥麻醉小鼠，迅速取出心臟，濾紙吸干水分后稱取HW，分離出左、右心房和左、右心室，并稱取LVM，計算HMI和LVMI。HMI=HM/BM，LVMI=LVM/BM。

1.4 各組小鼠心肌組織纖維化判斷指標(biāo)觀察

1.4.1 各組小鼠心肌組織觀察及膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)測算 取各組小鼠心臟組織標(biāo)本，置于盛有10%甲醛水溶液中固定，石蠟包埋、切片，按Masson染色試劑盒操作流程操作，使用Image-ProPlus軟件鏡下觀察拍照，并計算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。顯微鏡下，心肌組織為紅色，膠原纖維為藍(lán)色。CVF=膠原纖維染色面積/切片總面積×100%。

1.4.2 各組小鼠心肌組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白檢測 采用免疫組化法。取各組小鼠心臟組織標(biāo)本，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片機(jī)烤片，用0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，3%的BSA室溫封閉30 min，把濕盒放在4 ℃孵育一抗Ⅰ型膠原(1∶500)、Ⅲ型膠原(1∶500)過夜。第2天按試劑盒說明書孵育二抗，DAB顯色,蘇木素復(fù)染2 min后清洗，于乙醇梯度脫水后，二甲苯浸泡、干燥、封片，鏡下觀察并拍照，Image-J 6.0軟件分析。將對照組小鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達(dá)量均設(shè)為1，計算其他各組小鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 各組小鼠心肌組織中Smad3、P-Smad3蛋白檢測及P-Smad3/Smad3測算 采用Western Blotting法。取心臟組織剪碎，加入RIPA裂解液，使用超聲破碎儀裂解2 min后，靜置30 min，12 000 r/min高速離心10 min，留取上清，按BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。取樣本40 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入P-Smad3、GAPDH、Smad3特異性一抗，4℃孵育過夜，漂洗后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL發(fā)光試劑盒顯色，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照，ImageLab 6.0軟件軟件分析，計算心肌組織中Smad3、P-Smad3蛋白的相對表達(dá)量和P-Smad3/Smad3。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌重構(gòu)判斷指標(biāo)比較

2.1.1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較 ①對照組小鼠HR、LVIDs、LVIDd、EF%、FS%分別為(396.60±6.64)次/min、(1.43±0.13)mm、(2.84±0.27)mm、84.27%±4.69%、42.3%±2.31%，模型組分別為(431.1±9.75)次/min、(2.59±0.31)mm、(4.35±0.32)mm、53.14%±6.03%、30.1%±3.14%，兩組相比，P均<0.01。②LV-NC組小鼠HR、LVIDs、LVIDd、EF%、FS%分別為(429.9±7.31)次/min、(2.89±0.29)mm、(4.32±0.35)mm、50.48%±4.29%、31.8%±4.45%，LV-SKI組分別為(401.6±9.64)次/min、(2.19±0.41)mm、(3.98±2.68)mm、58.9%±4.75%、37.2%±2.25%，兩組相比，P均<0.01。

2.1.2 各組小鼠心臟HW、LVM、HMI和LVMI比較 ①對照組小鼠HW、LVM、HMI、LVMI分別為(125.1±4.78)mg、(104.3±5.83)mg、(4.54±0.39)mg/g、(4.36±0.42)mg/g，模型組分別為(140.5±7.32)mg、(118.4±6.89)mg、(5.94±0.56)mg/g、(5.41±0.29)mg/g，兩組相比，P均<0.01。②LV-NC組小鼠HW、LVM、HMI、LVMI分別為(141.9±5.15)mg、(121.6±5.89)mg、(6.07±0.56)mg/g、(5.39±0.48)mg/g，LV-SKI組分別為(134.5±5.26)mg、(111.6±4.12)mg、(5.38±0.33)mg/g、(4.90±0.46)mg/g，兩組相比，P均<0.01。

2.2 各組小鼠心肌組織纖維化判斷指標(biāo)比較

2.2.1 各組小鼠心肌組織及CVF比較 對照組可見心肌組織紅染，心肌細(xì)胞間可見少量膠原纖維，模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，間隔顯著增寬，間質(zhì)增多，可見有大量束狀的藍(lán)色膠原纖維；與模型組和LV-NC組相比，LV-SKI組上述病理變化有所減輕，心肌細(xì)胞數(shù)目有所增加，膠原纖維減少。對照組小鼠CVF為3.85%±0.61%、模型組為32.54%±3.12%，兩組相比，P<0.01。LV-NC組小鼠CVF為33.61%±2.61%、LV-SKI組為25.71%±2.28%，兩組相比，P<0.01。

2.2.2 各組小鼠心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達(dá)量比較 ①對照組小鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達(dá)量均設(shè)為1，模型組分別為3.03±0.39、3.87±0.27，兩組相比，P均<0.01。②LV-NC組小鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的相對表達(dá)量分別是3.11±0.19、3.84±0.26，LV-SKI分別為2.43±0.26、2.61±0.24，兩組相比，P均<0.01。

2.3 各組小鼠心肌組織中P-Smad3/Smad3比較 ①對照組小鼠P-Smad3/Smad3為0.64±0.06，模型組為1.39±0.02，兩組相比，P<0.05。②LV-NC組小鼠P-Smad3/Smad3為1.31±0.06，LV-SKI組為0.89±0.05，兩組相比，P<0.05。

3 討論

心肌纖維化屬于心肌中的瘢痕事件，主要以心肌成纖維細(xì)胞的活化、向肌成纖維細(xì)胞的分化和膠原蛋白增加為特征。成人心肌的主要成分是Ⅰ型膠原蛋白(約85%)和Ⅲ型膠原蛋白(約11%)，在正常的心肌中，膠原纖維對心肌收縮力的傳遞至關(guān)重要，在各種病理損傷后，膠原蛋白出現(xiàn)比例失調(diào)和異常沉積，使得心肌僵硬度增加，出現(xiàn)病理性重構(gòu)，導(dǎo)致心功能障礙甚至衰竭。因此，積極的抑制或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化進(jìn)程，可有效改善或延緩心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。

原癌基因c-SKI在機(jī)體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中都有重要作用，具有廣泛的生物學(xué)效性。目前關(guān)于c-SKI在心肌纖維化的調(diào)控方面的研究較少。研究[6]發(fā)現(xiàn)，沉默c-SKI的表達(dá)能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)心肌纖維化。沉默c-SKI還可以通過抑制ERK/CREB信號通路抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖。最新研究[7]報道，過表達(dá)c-SKI可以減少房顫的發(fā)作以及發(fā)作持續(xù)時間，抑制心肌纖維化并改善心肌重構(gòu)。此外，miR-34a/miR-93可以靶向c-SKI抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)沉積。本研究發(fā)現(xiàn)，給予異丙腎上腺素皮下注射30天后，模型組小鼠心臟超聲顯示LVIDs、LVIDd、HMI、LVMI均顯著升高，提示心肌出現(xiàn)病理性重構(gòu)；模型組小鼠心肌細(xì)胞可見結(jié)構(gòu)紊亂，間隔顯著增寬，間質(zhì)增多，大量的膠原纖維沉積，CVF升高，進(jìn)一步的免疫組化結(jié)果證實Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達(dá)量增多，均提示小鼠出現(xiàn)了胞外基質(zhì)沉積，發(fā)生心肌纖維化病理改變。過表達(dá)c-SKI后，與LV-NC組相比，LV-SKI組心臟超聲結(jié)果顯示LVIDs、LVIDd、HMI和LVMI均有所降低，EF%、FS%值則相對增加；Masson染色和免疫組化結(jié)果表明，與LV-NC組相比，LV-SKI組心肌細(xì)胞數(shù)目有所增加，膠原纖維減少，同時Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白相對表達(dá)量有所下降?？梢姡^表達(dá)c-SKI具有抑制心肌纖維化和膠原蛋白沉積作用，從而改善心肌重構(gòu)和心功能。

TGF-β/Smad信號通路與心肌纖維化關(guān)系最為密切，其中Smad蛋白是通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，而c-SKI則主要是通過抑制Smad蛋白的表達(dá)負(fù)性調(diào)控該通路的活性。研究[8]發(fā)現(xiàn)，在成纖維細(xì)胞中，c-SKI通過作用于TGF-β/Smad通路調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程。在心肌梗死小鼠模型中，c-SKI可通過抑制P-Smad2和P-Smad3蛋白的表達(dá)，抑制TGF-β/Smad通路激活，最終抑制心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少胞外基質(zhì)的沉積。同樣的，c-SKI通過抑制TGF-β1/Smad號通路改善犬房顫模型心房重構(gòu)，抑制心房纖維化進(jìn)程。此外，過表達(dá)c-Ski可通過調(diào)控Smad3信號通路促進(jìn)胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，以及通過抑制Smad3表達(dá)誘導(dǎo)肺癌患者耐藥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)c-SKI可以抑制小鼠心肌細(xì)胞中P-Smad3/Smad3的表達(dá)，與既往研究結(jié)果基本一致。而最新研究[9]表明，c-SKI是通過抑制PI3K/Akt信號通路來減少骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，由此可見c-SKI作用豐富且具多樣性，需要更全面的去了解。

綜上，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化進(jìn)程中，過表達(dá)c-SKI可以減輕小鼠心肌組織中纖維組織增生、膠原纖維減少，減少胞外基質(zhì)的沉積，具有一定抗心肌纖維化的作用，同時可以改善心功能、抑制心肌病理性重構(gòu)，為心肌纖維化相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。