β-catenin和MMP-3在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及臨床意義

菅永志，葉林，李躍軍，顧培倫，高鵬，羊鵬飛，楊童，王維山，董金波*

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆 石河子 832000；2 河南省鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3 河南省三門峽市中心醫(yī)院，河南 三門峽 472000；4 中國(guó)人民解放軍69026部隊(duì)，新疆 烏魯木齊 830000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是中老年常見的關(guān)節(jié)疾病，好發(fā)于人體承重關(guān)節(jié)，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨緩慢破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)周圍的增生。關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的退行性改變?cè)斐绍浌墙M織內(nèi)的成分丟失是造成關(guān)節(jié)軟骨破壞的原因之一。承重區(qū)域的軟骨因成分改變導(dǎo)致軟骨功能下降，進(jìn)而造成軟骨破壞[1]。在骨關(guān)節(jié)炎的各個(gè)發(fā)病部位中，以膝關(guān)節(jié)最容易發(fā)病，且疾病負(fù)擔(dān)較重[2]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號(hào)通路中的核心分子，廣泛分布于軟骨組織中的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞膜中。β-catenin信號(hào)通路的激活雖然對(duì)軟骨生長(zhǎng)發(fā)育早期十分重要，但過度的激活會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變和OA形成[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌，是MMPS家族的重要成員。它廣泛參與蛋白水解活性，包括蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、凝膠、Ⅳ型膠原和IX型膠原等的降解過程[4-5]，是關(guān)節(jié)軟骨損傷的重要因素之一。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)臨床OA患者及正常膝關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin和MMP-3的表達(dá)測(cè)定，初步探討其在OA發(fā)病過程中的重要作用及二者的相互關(guān)系，將有助于OA發(fā)生機(jī)理的全面認(rèn)識(shí)，為OA的預(yù)防、診斷、治療提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象選自2017年8月-2018年4月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、第三附屬醫(yī)院的行骨科手術(shù)的83名患者。術(shù)前詳細(xì)與患者及其家屬談話并簽署知情同意書，患者本人及家屬自愿捐獻(xiàn)廢棄的關(guān)節(jié)軟骨用于科學(xué)研究，本研究通過了石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。2018年4月16日至2018年6月15日在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科免疫組化室進(jìn)行HE染色及免疫組化試驗(yàn)。

1.1.1 OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)

OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)需嚴(yán)格按照2007年版《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》[6]的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行診斷，包括病史采集、查體、影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等。

表1 膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Diagnostic criteria for knee osteoarthritis

注：綜合臨床、實(shí)驗(yàn)室及X線檢查,符合1+2條或1+3+5+6條或1+4+5+6條,可診斷為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

在納入研究前，完善相關(guān)檢查，排除患有以下疾病患者：創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎、肝腎功能異常、惡性腫瘤和全身感染性疾病，以及檢測(cè)前2個(gè)月內(nèi)使用皮質(zhì)類固醇的病史。

1.1.3 研究分組

對(duì)已經(jīng)納入的83例患者依據(jù)OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將83例患者分為OA組和NOA組。OA組取自因骨性關(guān)節(jié)炎而行人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(TKA)(圖1)或因OA行關(guān)節(jié)鏡治療的手術(shù)患者。入院患者以發(fā)放問卷的形式收集OA患者的西安大略和麥克馬斯特大學(xué)(Western Ontario and McMaster University,WOMAC)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)，見附錄。WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分主要涉及疼痛、僵硬和關(guān)節(jié)功能3個(gè)大的方面，3個(gè)方面又細(xì)分為24個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)各占10分，總分240分。由于WOMAC指數(shù)主要關(guān)注OA對(duì)患者日常生活影響，當(dāng)患者主觀癥狀越重時(shí)，WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分越高，我們可以根據(jù)評(píng)分高低大致判斷患者的OA分度：輕度<80分，中度80-120分，重度>120分，通過收集WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分表，將70例OA患者，分為輕度OA組13例，中度組22例，重度組30例，NOA組13例，取自創(chuàng)傷后導(dǎo)致的截肢或部分軟骨脫落使用關(guān)節(jié)鏡可取出的患者。整理患者一般資料(表2)。

圖1 重度OA患者膝關(guān)節(jié)大體標(biāo)本及術(shù)中髁部軟骨面Fig.1 Gross knee specimens and intraoperative ankle cartilage surface in patients with severe OA

表2 各組基本資料對(duì)比Tab.2 Comparison of basic data of each group

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗體

鼠抗人β-catenin單克隆抗體、一抗MMP-3。二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔。

1.2.2 病理切片的制作

(1)取材：將取下的關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本修成0.3 cm～0.5 cm厚度，置于4%多聚甲醛(新配制)固定液中，環(huán)境溫度為4攝氏。(2)脫鈣：置于經(jīng)DEPC處理的15%-20%EDTA脫鈣液中進(jìn)行常規(guī)脫鈣4周。(3)脫水：(70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇Ⅰ→95%乙醇Ⅱ→正丁醇→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ)各2小時(shí)→二甲苯Ⅰ1.5小時(shí)→二甲苯Ⅱ2小時(shí)，石蠟Ⅰ→石蠟Ⅱ各2小時(shí)(60 ℃)，同時(shí)抽真空。石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)組織切片，切片放在生物組織展烤烘片。

1.2.3 HE染色

(1)石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ10 min、無水乙醇Ⅱ10 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min、蒸餾水洗。(2)蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。(3)伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1～3 min。(4)脫水封片：將切片依次放入95%乙醇I 5 min、95%乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片，并進(jìn)行Mankin評(píng)分。

1.2.4 MMP-3和β-catenin免疫組化染色

(1)石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，用PBS緩沖液洗3次，每次5 min。(2)切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10 min后低火至沸。(3)自然冷卻后再次使用PBS緩沖液洗3次，每次5 min。(4)將切片置于3%過氧化氫溶液中，在室溫下避光孵育10 min。(5)PBS緩沖液洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封閉20 min。(6)去除BSA液，每張切片加入約50 μL稀釋的一抗覆蓋組織，4 ℃過夜。(7)PBS緩沖液洗3次，每次5 min。去除PBS緩沖液液，每張切片加50～100 μL相應(yīng)種屬的二抗，37 ℃孵育50 min。(8)PBS緩沖液洗3次，每次5 min。去除PBS緩沖液，每張切片加50～100 μL新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化(約1 s)，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。(9)切片經(jīng)過梯度乙醇75%、90%、100%、100%，各10 min，脫水干燥，二甲苯透明，自然晾干后中性樹膠封固，加蓋玻片。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。

1.3 切片結(jié)果的判讀

切片結(jié)果由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科兩名病理專家獨(dú)立閱片并進(jìn)行評(píng)價(jià)。HE染色結(jié)果通過Mankin評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。Mankin評(píng)分是在顯微鏡下從軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)染色以及潮線完整性4個(gè)方面對(duì)軟骨進(jìn)行計(jì)分評(píng)價(jià)。四方面評(píng)分進(jìn)行相加得出每張切片的Mankin評(píng)分，總分在0-3分為正常軟骨，4-7分為輕度OA軟骨，8-11分為中度OA軟骨，12-14分為重度OA軟骨。免疫組化評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)采用半定量積分法[7]，即對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，同一標(biāo)本下兩者乘積來確定蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。染色強(qiáng)度評(píng)分為不著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。陽性細(xì)胞率即陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例，每張切片以計(jì)數(shù)10個(gè)40×10倍視野細(xì)胞為準(zhǔn)進(jìn)行觀察，根據(jù)切片上陽性細(xì)胞數(shù)量的不同分級(jí)：無著色細(xì)胞或僅有﹤10%觀察細(xì)胞著色，計(jì)為0分；陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%，計(jì)為1分；陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，計(jì)為2分；陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%，計(jì)為3分；陽性細(xì)胞數(shù)75%～100%，計(jì)為4分。表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分：0、1、2、3、4分為陰性，6、8、9、12分為陽性，分值越高我們認(rèn)為檢測(cè)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)和HE染色后鏡下觀察的結(jié)果

NOA組：可以看到正常軟骨面光滑，附有清亮的滑液，質(zhì)韌，彈性好，呈半透明狀態(tài)。關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜健康，無游離體形成，關(guān)節(jié)軟骨邊緣整齊，無骨贅和滑膜硬結(jié)。鏡下可以看到正常軟骨細(xì)胞排列規(guī)律整齊，呈橢圓形或近圓形，軟骨表面區(qū)域、移行區(qū)、輻射區(qū)、礦化區(qū)各個(gè)區(qū)域?qū)哟蚊鞔_，潮標(biāo)清晰完整。輕度OA：外觀可以看到軟骨表面欠光滑，呈淡黃色，附有淡黃色滑液，質(zhì)韌，彈性欠佳。有輕度軟化灶，可見微小裂紋?；ぽp度充血，無游離體形成，關(guān)節(jié)軟骨邊緣欠整齊。鏡下可以看到，表面區(qū)軟骨細(xì)胞稀疏，移行區(qū)軟骨細(xì)胞排列散亂。潮標(biāo)欠清晰。中度OA：外觀可以看到軟骨表面毛糙、干燥，呈暗黃色，失去光澤，附有黃褐色滑液。質(zhì)硬，彈性差。軟骨表面有中度軟化灶，有小塊軟骨缺失，裂紋增寬加深?；ぶ卸瘸溲樵錾?，部分關(guān)節(jié)內(nèi)有大小不一的游離體形成，關(guān)節(jié)軟骨不整齊，有骨贅和滑膜硬結(jié)形成。鏡下可以看到軟骨表面毛糙，表面區(qū)軟骨細(xì)胞排列凌亂，部分表面區(qū)和移行區(qū)軟骨細(xì)胞脫落丟失。輻射區(qū)細(xì)胞排列混亂無原有輻射狀，輻射區(qū)與移行區(qū)界限不清，潮標(biāo)模糊，不連續(xù)。

重度OA：外觀可以看到軟骨表面粗糙、干燥，呈暗黃色，失去光澤，附有少量黃褐色渾濁滑液。軟骨表面有大塊軟骨缺失，缺失處有骨質(zhì)裸露，骨質(zhì)表面有一層類似纖維軟骨的軟骨面，其余剩余軟骨表面有不同程度的裂紋并延伸至骨質(zhì)表面?；ぶ囟瘸溲?，伴大量增生，關(guān)節(jié)內(nèi)多有大小不一的游離體形成，關(guān)節(jié)軟骨邊界不清，有大量骨贅和滑膜硬結(jié)形成。鏡下可以看到軟骨表面粗糙，表面區(qū)軟骨細(xì)胞排列凌亂，大部分表面區(qū)和移行區(qū)軟骨細(xì)胞脫落丟失。軟骨表面區(qū)域、移行區(qū)、輻射區(qū)、礦化區(qū)各個(gè)區(qū)域?qū)哟位靵y不清，界限消失，潮標(biāo)模糊且不連續(xù)。

對(duì)HE染色的軟骨縱切面切片(圖2)進(jìn)行Mankin評(píng)分，表明通過臨床判斷收集的OA組患者的Mankin評(píng)分明顯高于NOA組(Z=-5.727，P<0.001)(表3)，各組軟骨Mankin評(píng)分，基本與WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分呈正性同步趨勢(shì)，表明軟骨嚴(yán)重程度與OA病程發(fā)展緊密相關(guān)，這說明我們收集的標(biāo)本完全符合實(shí)驗(yàn)的要求，為后面進(jìn)一步探究β-連環(huán)蛋白和MMP-3與OA的關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

表3 不同時(shí)期軟骨Mankin評(píng)分Tab.3 Cartilage Mankin scores at different times

A—正常關(guān)節(jié)軟骨；B—輕度OA；C—中度OA；D—重度OA(40×)圖2 正常膝關(guān)節(jié)及不同程度OA膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果Fig.2 HE staining results of normal knee joint and different degrees of OA knee articular cartilage

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 免疫組化法檢測(cè)軟骨組織中β-catenin的表達(dá)強(qiáng)度

β-連環(huán)蛋白在正常細(xì)胞內(nèi)廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中。而在OA軟骨細(xì)胞中多表表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)，在OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中有游離的β-連環(huán)蛋白分子(圖3)。結(jié)果表明，NOA組有2例為陽性，陽性率為15.38%；OA組關(guān)節(jié)軟骨中，輕度OA組10例陽性，陽性率55.56%；中度OA組17例，陽性率77.27%，重度OA組27例，陽性率90.00%。采用卡方檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P值帶有“*”為確切概率法結(jié)果，不帶的為卡方檢驗(yàn)結(jié)果)，結(jié)果OA觀察組與非OA對(duì)照組軟骨組織中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)相比，X2=19.053，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；NOA與輕度OA組相比較，X2=3.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NOA與中度OA組相比較，X2=12.612，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；NOA與中度OA組相比較，X2=22.997，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；輕度OA與中度OA組相比較，X2=2.128，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.145)；輕度OA與重度OA組相比較，X2=7.556，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中度OA與重度OA組相比較，X2=1.579，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.209)(表4)。

A—正常組；B—輕度OA；C—中度OA；D—重度OA(200×)圖3 各組軟骨組織中β-catenin表達(dá)情況Fig.3 Expression of β-catenin in cartilage tissue of each group

表4 各組β-catenin免疫組化染色結(jié)果Tab.4 Results of immunohistochemical staining of β-catenin in each group

2.2.2 軟骨組織中MMP-3蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)

MMP-3的陽性表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色或棕色顆粒。因OA發(fā)病過程中MMP-3作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維，所以我們猜測(cè)在OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中也存在游離的MMP-3分子。在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中應(yīng)該也能看到顏色變化(如圖4)。

結(jié)果表明，NOA組有1例為陽性，陽性率為7.69%；OA組關(guān)節(jié)軟骨中，輕度OA組9例陽性，陽性率50.00%；中度OA組14例陽性，陽性率63.64%，重度OA組25例陽性，陽性率83.33%。采用卡方檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P值帶有“*”為確切概率法結(jié)果，不帶的為卡方檢驗(yàn)結(jié)果)，結(jié)果OA組與非OA對(duì)照組軟骨組織中MMP-3的表達(dá)相比，X2=16.803，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；NOA與輕度OA組相比較，X2=6.183，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NOA與中度OA組相比較，X2=10.443，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NOA與重度OA組相比較，X2=21.708，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；輕度OA與中度OA組相比較，X2=0.753，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.385)；輕度OA與重度OA組相比較，X2=6.050，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中度OA與重度OA組相比較，X2=2.626，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.105)(表5)。

A—正常組；B—輕度OA；C—中度OA；D—重度OA(200×)圖4 各組軟骨組織中MMP-3表達(dá)情況Fig.4 MMP-3 expression in cartilage tissue of each group

表5 各組MMP-3免疫組化染色結(jié)果Tab.5 Immunohistochemical staining results of each group of MMP-3

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種蛋白的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)分析法我們發(fā)現(xiàn)，OA患者軟骨組織中β-catenin的表達(dá)與WOMAC指數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.787，P<0.001)，MMP-3的表達(dá)與WOMAC指數(shù)同樣呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.753，P<0.001)，結(jié)果表明β-catenin、 MMP-3與骨關(guān)節(jié)炎的病程變化密切相關(guān)；同理我們將OA患者軟骨組織中β-catenin、MMP-3的表達(dá)與Mankin評(píng)分做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，β-catenin的表達(dá)與Mankin評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.840，P<0.001)；MMP-3的表達(dá)與Mankin評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.774，P<0.001)，說明β-catenin、 MMP-3與OA軟骨的病變緊密相關(guān)；對(duì)β-catenin、 MMP-3在OA軟骨中表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)同樣存在呈顯著正相關(guān)(r=0.891，P<0.001)，提示我們兩種蛋白可能存在協(xié)同作用共同參與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過程(圖5)。

圖5 OA軟骨組織中β-catenin、MMP-3、WOMAC指數(shù)及Mankin評(píng)分之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between β-catenin,MMP-3,WOMAC index and Mankin score in OA cartilage tissue

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是中老年常見的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，對(duì)我國(guó)6個(gè)城市的居民進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果中膝骨關(guān)節(jié)炎總患病率為28.7%，其中男性23.5%，女性32.8%[8]。多種因素與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生有關(guān)，比如年齡、肥胖、性別、吸煙、飲酒等。目前被普遍所接受的觀點(diǎn)是膝骨關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明,其治療在早期因仍然缺乏有效的藥物，所以主要依靠局部熱敷、烤電、抗炎止痛等對(duì)癥治療。因此發(fā)病機(jī)制的深入研究及研發(fā)有效的治療藥物是十分必要的。近年來研究證實(shí)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和進(jìn)展是由力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨3者降解和合成正常偶聯(lián)失衡的結(jié)果。蛋白降解酶學(xué)說目前雖然不能解釋軟骨破壞的全部原因，但是不論軟骨的哪個(gè)部位以何種形式發(fā)生退變，都不能脫離蛋白降解酶的病理作用。此次我們通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了骨關(guān)節(jié)炎(OA)和非骨關(guān)節(jié)炎(NOA)組中β-連環(huán)蛋白和MMP-3蛋白的表達(dá)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討β-連環(huán)蛋白和MMP-3在OA發(fā)病機(jī)制中的作用及其相互關(guān)系如下。

3.1 OA的發(fā)病機(jī)制與關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的關(guān)系

關(guān)節(jié)軟骨(articular cartilage AC)存在于關(guān)節(jié)的表面，在動(dòng)物進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)生理負(fù)荷而產(chǎn)生一種富有彈性的組織。其主要作用包括關(guān)節(jié)的承重、潤(rùn)滑、吸收震蕩以及傳遞能量到軟骨下骨等[9]我們都知道AC由固體和液體物質(zhì)組成[10]。一般而言，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellu matrix，ECM)和軟骨細(xì)胞是AC的主要組成部分，ECM包括水、膠原纖維、PG、蛋白質(zhì)、脂肪、糖蛋白和無機(jī)鹽。膠原網(wǎng)架和水占據(jù)了干重的65%～80%和濕重的50%～80%。

AC結(jié)構(gòu)和功能的改變始終貫穿于OA的整個(gè)發(fā)展過程，大體標(biāo)本觀察我們可以發(fā)現(xiàn)AC的退化最終造成軟骨面的剝離和磨損嚴(yán)重，一般在膝關(guān)節(jié)內(nèi)髁的上下關(guān)節(jié)面上的軟骨完全消失，軟骨下骨質(zhì)裸露，以及新產(chǎn)生的用來代償正常軟骨作用的類纖維軟骨組織，其余部位軟骨表面可以看到明顯的軟骨裂隙。繼發(fā)性O(shè)A中AC的變化往往要比原發(fā)性O(shè)A中AC的變化要更為復(fù)雜。在原發(fā)性O(shè)A的AC中，膠原纖維隨著時(shí)間的推移和發(fā)展，機(jī)械性的退變?cè)贠A發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。原發(fā)性O(shè)A中，隨著年齡的變化OA中AC出現(xiàn)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞代謝的變化。KEMPSON等[11]于1982年發(fā)現(xiàn)，30～40歲的人群中AC的抗張力強(qiáng)度隨著年齡增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出正相關(guān)性。但往后，年齡越大AC的抗張力強(qiáng)度越弱，并提出AC這一改變是由膠原網(wǎng)架與膠原交聯(lián)共同退變的結(jié)果。與此同時(shí)，AC細(xì)胞分泌的PGs隨著年齡增加不斷減少造成膠原網(wǎng)架變硬，變脆，容易出現(xiàn)疲勞性的損傷[12-14]。膠原網(wǎng)架的半徑會(huì)不斷增大，半徑增大了的膠原網(wǎng)架柔韌性差，硬度高，再加上AC中含水量不斷下降，使得AC中的支架結(jié)構(gòu)不能適應(yīng)的起軟骨反復(fù)變形的狀態(tài)，從而出現(xiàn)動(dòng)態(tài)的失衡。與此同時(shí)，針對(duì)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的炎癥因子發(fā)揮本身的作用，對(duì)軟骨基質(zhì)進(jìn)行破壞來加快OA的發(fā)展，原本不能再生的正常軟骨不堪重負(fù)，直至毀滅。

3.2 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

Sharma等[15]早在1973年就在果蠅的胚胎中首次鑒定出了無翅基因wingless。隨后于1982 年，Nusse等[16]對(duì)無翅基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，int-1是小鼠乳腺腺瘤病毒(MMTV)致乳腺腫瘤的重要整合位點(diǎn)，后來這項(xiàng)研究證實(shí)了這個(gè)特殊的基因與果蠅的無翅基因同源，并命名為Wnt基因家族。經(jīng)典Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的一般過程可概括如下：Wnt→Frizzled→Dsh→β-連環(huán)素降解復(fù)合物解聚(GSK-3β是主要調(diào)節(jié)因子)核內(nèi)β-連環(huán)蛋白積累→TCF /LEF1 →下游靶基因轉(zhuǎn)錄(如MMP3、MMP13、BMP、c-myc、cyclinD1)[17]。β-連環(huán)蛋白是細(xì)胞內(nèi)糖蛋白家族的一員。具有多種功能，廣泛分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。Hartmann等[18]應(yīng)用雞卵內(nèi)接種法首次證明Wnt信號(hào)與關(guān)節(jié)形成早期階段的關(guān)系。Day等[19]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和HILL等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物關(guān)節(jié)的形成和發(fā)育受Wnt9a和Wnt16蛋白調(diào)控的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路和Wnt4調(diào)控的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路共同調(diào)控。還有SPATER等[21]的研究提出，Wnt信號(hào)通路與印第安刺猬蛋白的調(diào)控作用似乎在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育過程起到相互協(xié)同的作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育比原來的理論更為復(fù)雜。研究證實(shí)，一些Wnt蛋白在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解、骨形成和吸收、軟骨和骨生物力學(xué)等方面發(fā)揮了特殊作用[22]。Yuasa等[23]人提出通過Wnt3A可以激活兔AC的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，使得MMP-3的基因表達(dá)增強(qiáng)。與之相一致，2009年Ge X[24]等人通過IL-1β的作用上調(diào)了Wnt-5a的表達(dá)使得兔AC中MMP-3表達(dá)量升高。人骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)也很高，軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)破壞的原因可能與β-連環(huán)蛋白對(duì)MMP-3的表達(dá)升高有關(guān)。

Zhu M等[25]人研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白的過度表達(dá)不僅導(dǎo)致小鼠膝關(guān)節(jié)OA樣改變，而且導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中MMP-9、MMP-13和BMP-2基因呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。與之相一致的是，人骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)也很高。軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)破壞的原因可能與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)對(duì)MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MT3MP和ADAMTS5的顯著表達(dá)有關(guān)[26]。PAPATHANASIOU等[27]發(fā)現(xiàn)激活W狀態(tài)下的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，通過高表達(dá)MMPs及蛋白聚糖酶5，使得AC中細(xì)胞外基質(zhì)中的部分蛋白質(zhì)和膠原網(wǎng)架降解，使AC的結(jié)構(gòu)和功能難以維持。

綜上所述Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在OA的發(fā)病機(jī)制中是十分重要的。β-連環(huán)蛋白是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心分子。上游分子通過β-連環(huán)蛋白傳遞信號(hào)，發(fā)揮其作用[28]。結(jié)果表明，OA組β-連環(huán)蛋白的表達(dá)明顯高于正常組，與以往文獻(xiàn)一致[29]。β-連環(huán)蛋白的上調(diào)間接提示W(wǎng)nt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在OA軟骨組織中被激活，并誘導(dǎo)下游基因MMP的表達(dá)。

3.3 MMP-3與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

基質(zhì)金屬蛋白酶家族 (matrix metalloproteinases，MMPs) 是一個(gè)龐大的大家族，它們因其需要金屬離子輔助的作用而得名。MMP的成員結(jié)構(gòu)非常相似，大多數(shù)MMP由5個(gè)功能域組成?；|(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌，是MMPS家族的重要成員。它廣泛參與蛋白水解活性，包括蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、凝膠、Ⅳ型膠原和IX型膠原等的降解過程[5]，是關(guān)節(jié)軟骨損傷的重要因素之一。MMP-3的作用不只是自身有破壞軟骨基質(zhì)的作用，高表達(dá)狀態(tài)下還激活了其他MMPs家族成員，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，從而加重炎性反應(yīng)，共同降解關(guān)節(jié)軟骨[30]。

本研究結(jié)果表明，OA軟骨組織中MMP-3的表達(dá)明顯高于正常組，與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與以往報(bào)道一致[31]。骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨、滑膜和滑液中MMP-3的表達(dá)與骨性關(guān)節(jié)炎病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[32]。由此進(jìn)一步證明，軟骨組織中的MMP-3的過量表達(dá)可直接或間接通過關(guān)節(jié)液作用于關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜，加速OA病程的發(fā)展。

3.4 軟骨組織中β-連環(huán)蛋白和MMP-3的相互關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMPS家族基因的表達(dá)水平[33]。此外，Wnt-3a在培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨中激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)可顯著提高明膠酶活性，增加mmp-3和mmp-13的表達(dá)[23]。MMP-3是MMPS家族的重要成員。

通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，OA軟骨組織中β-連環(huán)蛋白和MMP-3的表達(dá)相似。兩者在OA軟骨組織中均有高表達(dá)，與關(guān)節(jié)退變程度呈正相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)整理與回歸分析后發(fā)現(xiàn)MMP-3和β-catenin的表達(dá)之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活上調(diào)了MMP-3的表達(dá)，加速了病程的發(fā)展。但有研究證實(shí)兩者之間在基因水平并無明顯相關(guān)性，提示我們MMP-3的表達(dá)不僅受單一Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控?？赡苓€有其他方法來調(diào)節(jié)這種復(fù)雜機(jī)制的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究[32]?？偟膩碚f在OA病變過程中β-catenin和MMP-3均發(fā)揮著重要的作用，β-catenin在參與OA軟骨退變的病理變化過程中可能通過干預(yù)Wnt信號(hào)通路的方式引起MMP-3表達(dá)變化。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制不是單一因素，可能涉及多種細(xì)胞信號(hào)通路，具有復(fù)雜性。關(guān)節(jié)軟骨中β-catenin和MMP-3的表達(dá)較非骨關(guān)節(jié)炎組顯著增強(qiáng)，且隨著OA不斷加重這兩種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，這兩種蛋白可作為OA早期診斷的依據(jù)。OA 軟骨組織中β-catenin、MMP-3表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示β-catenin、MMP-3共同參與了OA發(fā)生發(fā)展中軟骨組織的破壞，兩者對(duì)OA的發(fā)生可能存在協(xié)同作用。基于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的靶點(diǎn)治療可能在 OA 治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中獲得突破，后期需加大樣本量選取更多靶點(diǎn)及方向進(jìn)行研究，使理論更加完善，這是我們后期實(shí)驗(yàn)的主要任務(wù)。