酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠CD4+ T細(xì)胞CD28和PD1表達(dá)的影響及意義

方 玢，秦道建，唐宗生,陶雨琦,鄭雨微,張士發(fā)

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 a.兒科;b.輸血科，安徽 蕪湖 241001；2.安徽省立醫(yī)院 兒科，安徽 合肥 230000)

世界衛(wèi)生組織將早產(chǎn)兒定義為在妊娠37周或259天內(nèi)出生的新生兒[1]。早產(chǎn)兒免疫功能低下導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可能是重要原因之一。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，T淋巴細(xì)胞的活化需要CD28和PD1等共刺激分子的參與，CD28對(duì)T細(xì)胞的存活因子IL-2的產(chǎn)生和Bcl-xL的上調(diào)至關(guān)重要，PD1負(fù)向調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞的增殖與活化[2]。益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，能夠改善腸道的微生態(tài)平衡，并能刺激腸黏膜免疫組織，增強(qiáng)腸道免疫力[3]。然而，關(guān)于益生菌是否影響T細(xì)胞的活化及其影響機(jī)制的研究較少。本研究通過(guò)給予早產(chǎn)小鼠酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌灌胃，動(dòng)態(tài)觀察CD4+T細(xì)胞表面CD28和PD1的表達(dá)情況，探討酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠CD4+T細(xì)胞CD28和PD1表達(dá)的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌購(gòu)于山東科興生物制品公司；米非司酮由深圳市資福藥業(yè)有限公司提供；Hamster Anti-mouse CD3e FITC、Rat Anti-Mouse CD4 PE-CYTM5、Rat Anti-Mouse CD8a PE-CYTM7(美國(guó)BD Pharminge公司)；Anti-Mouse CD279 PE、Anti-Mouse CD28 PE(美國(guó)e Bioscience公司)；小鼠紅細(xì)胞裂解液(Biosharp公司)；高速低溫離心機(jī)、各種規(guī)格移液器(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)器械廠)；XW-80A 旋渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造公司)。

1.2 動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)BALB/c健康成年小鼠(雌性18只，雄性9只)，體質(zhì)量18～22 g(江蘇省南京市青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供)，雌雄小鼠采用2∶1配對(duì)飼養(yǎng)。

1.3 早產(chǎn)及足月小鼠造模 用米非司酮(RU486)腹腔注射無(wú)菌孕鼠建立早產(chǎn)模型[4]。雌鼠檢查到陰栓記為妊娠第1天，單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)選擇部分孕鼠于孕第18天及第19天晨8點(diǎn)腹腔注射用蓖麻油溶解的米非司酮(劑量0.15 mg/kg,)，獲得胎齡<20 d的新生早產(chǎn)小鼠。另外的孕鼠待其自然分娩，收集胎齡>20 d的新生足月小鼠。

1.4 分組及給藥 隨機(jī)將P1早產(chǎn)小鼠分為早產(chǎn)實(shí)驗(yàn)組(Ⅰ組)和早產(chǎn)對(duì)照組(Ⅱ組)，同日齡足月小鼠為足月對(duì)照組(Ⅲ組)，每組16只。Ⅰ組給予酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌灌胃[5](灌胃體積為100 μL/10g)，同一時(shí)間，給予Ⅱ組與Ⅲ組等量生理鹽水灌胃,均于灌胃后按窩返回母鼠身邊飼養(yǎng)。

1.5 取血 各組分別在P14、P21隨機(jī)選取小鼠8只，乙醚麻醉，眼球取血法取血>500 μL，EDTA-K2抗凝后，置于冰上備用。

1.6 CD28和PD1分子檢測(cè) 取2只流式管分別標(biāo)為①、②，向兩管中各加入100 μL stain buffer、熒光標(biāo)記的抗體CD3e-FITC、CD4-PEcy5、CD8-PEcy7各1 μL；再向①管中加入1 μL CD279-PE，②管加入1 μL CD28-PE;兩管中各加入外周血100 μL，避光孵育20 min；兩管分別加入鼠紅細(xì)胞裂解液2 mL，裂解2 min，1500 rpm離心5 min，重復(fù)1次；兩管加stain buffer各2 mL，1500 rpm離心5 min，倒去上清液，重復(fù)1次；兩管加stain buffer各700 μL后上機(jī)檢測(cè)；采用 Flow Jo VX 軟件進(jìn)行CD28、PD1的表達(dá)量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Holm-Sidak檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較，兩組間、組內(nèi)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早產(chǎn)對(duì)小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28表達(dá)水平的影響 詳見(jiàn)圖1。圖1A為新生小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28表達(dá)圖。在P14，Ⅱ組小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28的表達(dá)與Ⅲ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.073)；而在P21，Ⅱ組CD28的表達(dá)量高于Ⅲ組(P=0.040)，見(jiàn)圖1B。并且Ⅱ組CD28的表達(dá)量隨日齡的增加而升高(P=0.024)；而Ⅲ組CD28的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)未見(jiàn)明顯變化(P=0.108)，見(jiàn)圖1C。

2.2 早產(chǎn)對(duì)小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD1表達(dá)水平的影響 詳見(jiàn)圖2。圖2A為新生小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD1表達(dá)圖。在P14，Ⅱ組小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD1的表達(dá)與Ⅲ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.225)；而在P21，早產(chǎn)對(duì)照組PD1的表達(dá)量高于Ⅲ組(P=0.000)，見(jiàn)圖2B。并且Ⅱ組PD1的表達(dá)量隨日齡的增加升高(P=0.000)；而Ⅲ組PD1的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)未見(jiàn)明顯變化(P=0.393)，見(jiàn)圖2C。

2.3 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28表達(dá)的影響 詳見(jiàn)圖3。在P14和P21，Ⅰ組 CD4+T細(xì)胞表面CD28的表達(dá)均高于Ⅱ組(t=6.784,t=4.577,P均=0.000)和Ⅲ組(t=4.315,t=6.746,P均=0.000)，見(jiàn)圖3A。而Ⅰ組CD28的表達(dá)在P14與P21未見(jiàn)明顯差異(t=1.567,P=0.139),見(jiàn)圖3B。

圖1 早產(chǎn)與足月小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28表達(dá)的比較

圖2 早產(chǎn)與足月小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD1表達(dá)的比較

圖3 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠CD28表達(dá)的影響

2.4 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠CD4+T細(xì)胞表面PD1表達(dá)的影響 詳見(jiàn)圖4。在P14和P21，Ⅰ組CD4+T細(xì)胞表面PD1的表達(dá)均高于Ⅱ組(t=25.06,t=2.879,P均<0.05)和Ⅲ組(t=24.06,t=8.611,P均=0.000)，見(jiàn)圖4A。而Ⅰ組PD1的表達(dá)量隨日齡增加明顯降低(t=9.314,P=0.000),見(jiàn)圖4B。

3 討論

酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌是酪酸梭狀芽孢桿菌和嬰兒型雙歧桿菌混合制劑，可以促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，維持腸道菌群的平衡，對(duì)腸道內(nèi)病原菌的抑制有顯著作用[6]。Ling等[7]發(fā)現(xiàn)酪酸梭菌雙歧桿菌混合物可能是治療抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)的一種簡(jiǎn)單有效的方法。有臨床研究表明[8]，肺炎住院兒童在應(yīng)用抗生素的基礎(chǔ)上加用酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌，可有效降低其發(fā)生AAD的風(fēng)險(xiǎn)，未發(fā)現(xiàn)其不良反應(yīng)。

圖4 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對(duì)早產(chǎn)小鼠PD1表達(dá)的影響

PD1信號(hào)通過(guò)多種機(jī)制抑制T細(xì)胞的免疫功能，如抑制自身反應(yīng)性初始T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)效應(yīng) T細(xì)胞向Tregs轉(zhuǎn)化以及通過(guò)激活Tregs或 DC等來(lái)抑制效應(yīng)T細(xì)胞[9]，通過(guò)干擾CD28介導(dǎo)的PI3K激活而抑制Akt磷酸化，從而阻斷T細(xì)胞的增殖與活化[2]。有研究表明[10]，用抗CD80 mAb和抗4-1BBL mAb阻斷CD28/B7-1協(xié)同刺激途徑，均可明顯抑制T細(xì)胞增殖，且阻斷CD80對(duì)于CD4+T細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于阻斷4-1BBL 產(chǎn)生的抑制作用，即CD28/B7-1對(duì)CD4+T細(xì)胞的增殖具有重要作用。Hui E等[11]發(fā)現(xiàn)共受體 CD28是 PD1受體 Shp2磷酸酶去磷酸化的首選靶點(diǎn)，并且在完整的細(xì)胞系統(tǒng)中，PD-L1激活 PD1后，CD28而不是 TCR 優(yōu)先被去磷酸化，提示PD1主要通過(guò)阻斷CD 28信號(hào)通路而抑制T細(xì)胞功能。

正常足月兒在妊娠的最后3個(gè)月高度依賴(lài)經(jīng)胎盤(pán)傳遞的母親的 IgG活化T細(xì)胞來(lái)控制病原體，然而，早產(chǎn)兒經(jīng)胎盤(pán)傳遞的母體抗體顯著減少，先天免疫不成熟，因此發(fā)育過(guò)程會(huì)引起早產(chǎn)兒的先天免疫反應(yīng)的差異，使他們面臨嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。Bo等[13]人研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于足月兒，早產(chǎn)兒生后CD4+、CD8+及CD4+/CD8+有追趕趨勢(shì)。本研究表明，在P14，Ⅱ組CD28的表達(dá)與Ⅲ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在P21，Ⅱ組高于Ⅲ組(P<0.05)，隨著天數(shù)的延長(zhǎng)，Ⅲ組CD28的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，而Ⅱ組有上升趨勢(shì)(P<0.05)，即Bo等人發(fā)現(xiàn)的追趕趨勢(shì)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，在P21，PD1的表達(dá)Ⅱ組高于Ⅲ組(P<0.05)，并且隨著日齡增加，Ⅱ組PD1的表達(dá)逐漸增多(P<0.05)，而Ⅲ組未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，可能是機(jī)體為維持免疫平衡而進(jìn)行的自身調(diào)節(jié)，表明早產(chǎn)使小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表面CD28和PD1的表達(dá)出現(xiàn)異常。李國(guó)軍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用益生菌治療后的早產(chǎn)兒CD4+、CD4+/CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群均高于對(duì)照組，表明益生菌可能通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增值，提高早產(chǎn)兒的免疫功能。本研究與李國(guó)軍等[14]取得相似的研究成果。在P14和P21，Ⅰ組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表面CD28表達(dá)水平均高于Ⅱ組(P<0.05)和Ⅲ組(P<0.05)，表明給予早產(chǎn)小鼠酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌明顯加快了“追趕”的進(jìn)度并且超過(guò)了同時(shí)間段足月小鼠的水平，說(shuō)明酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌能促進(jìn)早產(chǎn)小鼠產(chǎn)生更多活化的CD4+T細(xì)胞，使其具有更高的免疫功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，在P14和P21，Ⅰ組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表面PD1表達(dá)水平也均高于Ⅱ組(P<0.05)和Ⅲ組(P<0.05)，但是隨著日齡增加，Ⅰ組PD1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)?？赡苁窃绠a(chǎn)小鼠免疫功能異常，但是給予酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌治療后，促進(jìn)T細(xì)胞增殖與活化的CD28分子表達(dá)增多，抑制性信號(hào)分子PD1的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)后因酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌的干預(yù)繼而開(kāi)始下調(diào)。提示酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌可能通過(guò)介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞表面CD28/PD1表達(dá)的上升或下降，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的成熟與活化，從而改善早產(chǎn)小鼠的免疫功能。

需要指出的是，本文也存在一些不足：①各組的樣本數(shù)量不夠多；② 因幼鼠出生后體積小，取血量不足，未能有效記錄早期數(shù)據(jù)；③人與小鼠還是存在差異，后續(xù)研究需擴(kuò)大樣本量以及進(jìn)行相應(yīng)的臨床試驗(yàn)，使研究結(jié)果更具權(quán)威性。

綜上所述，早產(chǎn)導(dǎo)致小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD28和PD1的表達(dá)出現(xiàn)異常，給予早產(chǎn)小鼠酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌，可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞表面CD28和PD1的表達(dá)，促進(jìn)早產(chǎn)小鼠免疫功能的發(fā)育和成熟。