利用引物探針序列構(gòu)建轉(zhuǎn)基因馬鈴薯檢測陽性重組質(zhì)粒及其驗證

楊杰 李蘭 戴莉 張江國 莫善明 徐新龍

摘要?[目的]通過將特定轉(zhuǎn)基因檢測方法引物和探針序列重組拼接，并將重組序列連接至質(zhì)粒中，驗證其作為轉(zhuǎn)基因檢測陽性對照的可行性。[方法]通過搭橋PCR和全基因合成的方法制備陽性重組序列，驗證陽性重組序列作為陽性對照品的可行性與陽性重組質(zhì)粒的均一性、穩(wěn)定性。[結(jié)果]通過將引物探針序列順序拼接構(gòu)建得到的陽性重組質(zhì)粒的性狀均一，在4和-20℃條件下均能穩(wěn)定產(chǎn)生陽性結(jié)果。[結(jié)論]該種陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法能夠滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測方法中陽性對照品的要求。

關(guān)鍵詞?引物;探針序列;轉(zhuǎn)基因檢測;搭橋PCR;陽性重組質(zhì)粒

中圖分類號?Q?943.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0213-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.062

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Construction of Transgenic Potato Detection Positive Recombinant Plasmid by Primer Probe Sequence and Its Validation

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al

（Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract?[Objective]The primers and probe sequences of specific GMO detection method were recombined and spliced， and the recombinant sequences were linked to the plasmid.To verify its feasibility as a positive control for GMO detection.[Method]Positive recombinant sequences were prepared by overlap PCR and whole gene synthesis to verify the feasibility of using positive recombinant sequences as positive reference materials and the homogeneity and stability of positive recombinant plasmid.[Result]The positive recombinant plasmids constructed by sequential splicing of primer probe sequences were uniform in character and could produce stable positive results at 4 ℃ and -20 ℃.[Conclusion]The construction method of the positive recombinant plasmid can meet the requirements of the positive control in the detection of GMO.

Key words?Primer;Probe sequence;GMO detection;Overlap PCR;Positive recombinant plasmid

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，基因檢測技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全等各個領(lǐng)域。但由于PCR檢測過程中對檢測目標(biāo)的不能直觀可見，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，在檢測環(huán)節(jié)中陰性、陽性及空白對照組的設(shè)立直接關(guān)系到檢測的判定。對一個檢測實驗室來說，陽性對照物的獲得往往是一個檢測工作能否順利開展的關(guān)鍵因素。

在一個定性PCR檢測工作中，一般采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為檢測的陽性對照組。用作PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)根據(jù)來源一般可分為3類[1]：第1類是基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通常是以含有目標(biāo)檢測物的植物組織或植物產(chǎn)品經(jīng)粉碎加工制成的粉末，使用時一般在檢測過程中與測試樣品一同處理進行核酸提取并進行PCR檢測;第2類是含有目標(biāo)檢測物基因組DNA/RNA溶液，使用時可以作為某檢測樣品全部內(nèi)外源檢測片段的陽性對照模板;第3類是含有目標(biāo)檢測物某個檢測片段基因序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，使用時需要根據(jù)所檢測的基因片段選擇所需的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子[2]。

根據(jù)Taqman探針實時熒光PCR檢測的原理，檢測方法的特異性是由其引物探針的序列特征決定的[3]，而引物探針區(qū)域之間的序列對擴增和檢測結(jié)果并不會造成明顯影響。據(jù)此，該研究通過將特定檢測方法引物探針序列重組拼接合成，即可獲得一段能用作該檢測方法陽性對照的DNA序列;再通過搭橋PCR和全基因合成技術(shù)[4]，將具體檢測標(biāo)準(zhǔn)中全部被測基因陽性重組序列順序拼接并進行連接至克隆載體上復(fù)制克隆，可得到一個適用于具體檢測方法中全部檢測片段的陽性重組質(zhì)粒，從而形成一套不依靠陽性樣品獲得同時既方便易得又通用可靠的陽性質(zhì)粒的制備方法。

1?材料與方法

1.1?陽性物質(zhì)

試驗使用轉(zhuǎn)基因陽性玉米樣品為2016年由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織的糧食轉(zhuǎn)基因檢測能力驗證計劃（計劃編號：ACAS-PT215）中檢出的陽性轉(zhuǎn)基因玉米粉，轉(zhuǎn)基因陽性馬鈴薯樣品為2015年遼寧出入境檢驗檢疫局組織的能力驗證項目（計劃編號PTC-T112）中陽性轉(zhuǎn)基因品系EH92-527-1馬鈴薯淀粉。

1.2?試劑設(shè)備

植物基因組DNA提取試劑盒DP305、2×Taq PCR MasterMix PCR預(yù)混液，天根生物技術(shù)有限公司;高效 DNA 凝膠回收試劑盒，GeneView公司;

D-5瓊脂糖凝膠、LM SIEVE低熔點瓊脂糖凝膠及熒光標(biāo)記探針，寶生物工程（大連）有限公司;LightCycler 480 Probes Master PCR預(yù)混液，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司;序列合成及序列測定為北京鼎國生物技術(shù)有限公司。 熒光定量PCR儀為羅氏LightCycler 96。

1.3?NOS終止子基因陽性重組序列的搭橋PCR連接及驗證?將SNT 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》[5]中NOS終止子基因檢測引物探針序列拼接為84 bp的陽性重組序列（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAAACGCGATAGAAAACAAAATATAGCG），由于片段過長，不易直接合成，拆分為NU片段（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGAT

GGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCA）、ND片段（CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTTTGCGGGACTCTAATCATAAA

AAC）兩段序列進行搭橋PCR連接。

將合成好的NU和ND片段稀釋為10-6 μmol/L，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中NOS終止子基因檢測引物為上下游引物PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL進行配制，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，35個循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并回收80 bp左右電泳條帶。

將回收的PCR產(chǎn)物進行稀釋后作為模板對NOS終止子基因進行檢測，以SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中規(guī)定進行PCR體系配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。

1.4?CaMV35S啟動子基因與NOS終止子基因二元陽性重組序列的連接及驗證?設(shè)計CaMV35S與NOS連接接頭引物C-N：5′-TGACGCACAATCCCACTATCGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTG-3′，以梯度稀釋為10-6的NU、ND連接產(chǎn)物為模板，以10 μmol/L 接頭引物C-N作為上游引物，SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中NOS終止子基因檢測下游引物為下游引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL進行配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35個循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并回收90 bp左右電泳條帶。

設(shè)計合成CaMV35S陽性重組序列C0：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGACGCACAATCCCACTATC-3′，以NU、ND拼接后帶接頭產(chǎn)物和C0為模板，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中CaMV35S啟動子基因上游引物、NOS終止子基因下游引物為上下游引物進行搭橋PCR連接。PCR反應(yīng)體系按照20 μL體系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL進行配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35個循環(huán)。配制2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并回收140 bp左右電泳條帶。

將回收的PCR產(chǎn)物進行稀釋作為模板對CaMV35S啟動子基因和NOS終止子基因進行檢測，以SN/T 1198—2013 《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中規(guī)定進行PCR體系配制，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。

1.5?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因引物探針序列重組陽性質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證

1.5.1?基因馬鈴薯外源基因陽性重組序列的設(shè)計。

根據(jù)SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中表A.2中實時熒光PCR定性檢測轉(zhuǎn)基因馬鈴薯成分引物和探針序列，將CaMV35S、FMV35s、NOS、NPTII、CP4 EPSPS、PLRVrep、PVYep、Cry3A、EH92-527-1全部9個外源基因拼接為完整的陽性重組序列。

為區(qū)別檢測陽性結(jié)果中是否發(fā)生陽性重組序列的污染，因此在CaMV35S探針序列和下游引物序列間插入一段外源序列5′-TATGAGCCTGGAGCGCA-3′作為標(biāo)記探針LLI，利用以該序列設(shè)計的探針進行檢測，可以將陽性重組序列與陽性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品區(qū)分開。序列信息見表1。

1.5.2?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽性重組質(zhì)粒的正確性驗證。將重組序列送交北京鼎國生物技術(shù)有限公司進行全基因序列合成，并連接至pES載體，轉(zhuǎn)化至受體菌DH5α中進行克隆并測序驗證。

1.5.3?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽性重組質(zhì)粒的均勻性驗證。

將驗證正確的轉(zhuǎn)化體進行搖培，提取陽性重組質(zhì)粒。將提取得到的陽性重組質(zhì)粒稀釋到10 ng，分裝為100份的管中，隨機挑選其中重組質(zhì)粒15份，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》規(guī)定體系和程序?qū)ν庠椿蜻M行檢測，分析檢測結(jié)果Ct值的平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是否符合使用要求。

1.5.4?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因陽性重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性驗證。

將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置在4、-20 ℃條件下進行保存，分別在7、15、30、90 d時，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》規(guī)定體系和程序?qū)ν庠椿蜻M行檢測。

1.5.5?重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)基因樣品檢測效果的驗證。

分別提取50 mg含有轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH92-527-1品系成分的淀粉樣品、轉(zhuǎn)基因玉米陽性樣品、非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯樣品的基因組DNA各一份，按照SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》規(guī)定體系和程序?qū)ζ鋬?nèi)外源基因進行篩查檢測。使用非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯基因組DNA作為陰性對照組模板，陽性重組質(zhì)粒作為陽性對照組模板。同時對樣品和對照組進行標(biāo)記探針的檢測，檢測使用SNT 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》中CaMV35S上下游引物和標(biāo)記探針LLI，反應(yīng)程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。

2?結(jié)果與分析

2.1?NOS終止子基因陽性重組序列的搭橋PCR連接?NU、ND片段搭橋PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1?；厥者B接產(chǎn)物進行NOS終止子基因檢測結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，搭橋PCR成功將NU、ND片段連接為完整的NOS基因陽性重組序列，序列能夠?qū)OS終止子基因的實時熒光PCR檢測方法產(chǎn)生陽性結(jié)果。

2.2?二元陽性重組序列的連接

NOS終止子基因陽性重組序列通過PCR加C-N接頭后與C0搭橋PCR連接合成CaMV35S啟動子-NOS終止子二元陽性重組序列，電泳結(jié)果見圖3。

對連接產(chǎn)物進行CaMV35S啟動子、NOS終止子基因檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，二次搭橋PCR成功將連接得到的NOS陽性重組序列與CaMV35S陽性重組序列連接產(chǎn)物能夠有效對CaMV35S啟動子、NOS終止子基因的實時熒光PCR檢測方法產(chǎn)生陽性結(jié)果。

2.3?轉(zhuǎn)基因馬鈴薯外源基因引物探針序列重組陽性質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證

根據(jù)北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司全基因合成試驗服務(wù)結(jié)題報告（報告編號：KT17227），試驗成功構(gòu)建含有目的基因全序列628 bp的pES質(zhì)粒載體，并成功轉(zhuǎn)化克隆至受體菌DH5α中，插入片段經(jīng)PCR擴增和測序檢驗與目標(biāo)序列一致。

經(jīng)檢測，全部15份陽性重組質(zhì)粒均能夠穩(wěn)定呈現(xiàn)陽性檢測結(jié)果且Cq值穩(wěn)定（表2），陽性重組質(zhì)粒在4、-20℃條件下均穩(wěn)定呈現(xiàn)陽性結(jié)果（表3），符合檢測均勻性和穩(wěn)定性的要求。通過將重組陽性質(zhì)粒作為陽性對照品對轉(zhuǎn)基因樣品進行檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5和表4），EH92-527-1陽性樣品內(nèi)源基因、外源NOS終止子、NPTII、EH92-527-1基因呈陽性，其余外源基因呈陰性;轉(zhuǎn)基因陽性玉米樣品CaMV35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS、Cry3A基因呈陽性，其余外源基因呈陰性;陽性重組質(zhì)粒外源基因均呈陽性，內(nèi)源基因呈陰性，結(jié)果正常;并且標(biāo)記探針LLI檢測僅陽性重組質(zhì)粒結(jié)果呈陽性。

3?討論

3.1?通過引物探針序列重組陽性質(zhì)粒的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及，實時熒光PCR檢測方法已經(jīng)逐漸擴展到生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品科學(xué)等各個領(lǐng)域[6]，其高靈敏度、高分辨率、快速便捷、規(guī)范性操作等優(yōu)勢在對檢驗檢測標(biāo)準(zhǔn)化需求日漸嚴(yán)格的今天更加凸顯出來。但由于PCR檢測過程中的檢測目標(biāo)的不能直觀可見，需要對在全過程中可能影響檢測結(jié)果因素逐一進行驗證排除，因此在各個檢測環(huán)節(jié)中合理設(shè)置陰性、陽性及空白對照組直接關(guān)系到檢測結(jié)果的可靠性與否。根據(jù)現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，在轉(zhuǎn)基因檢測過程中需要設(shè)立陽性目標(biāo)DNA對照、陰性目標(biāo)DNA對照、PCR抑制對照、擴增試劑對照、提取空白對照、陽性提取對照、環(huán)境對照這七大類對照組試驗。其中陽性目標(biāo)DNA對照、PCR抑制對照、陽性提取對照3類對照組均需要使用對應(yīng)每個檢測目標(biāo)基因的陽性對照品來開展試驗?？梢哉f如果一個實驗室想要建立一個實時熒光PCR檢測能力，陽性對照品的獲得是其能否成功的關(guān)鍵因素。

以往檢測過程中所使用的陽性物質(zhì)一般為各類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或經(jīng)權(quán)威機構(gòu)確認(rèn)鑒定的陽性樣品，這些陽性樣品能夠滿足不同情況的使用需求。但從實際工作出發(fā)，檢測機構(gòu)的檢測需求千變?nèi)f化，受不同時間空間等因素的影響很大，而各類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得本質(zhì)上都基于陽性樣品的獲得。對于沒有市售途徑、收到貿(mào)易制約、上市時間久遠(yuǎn)或生物安全風(fēng)險較高的陽性樣品往往難于獲得。在有檢測需求時卻不能及時獲得合適的陽性對照品很有可能會成為制約一個檢測機構(gòu)檢測能力發(fā)展的重要因素。

基于水解探針法的實時熒光PCR原理，通過將具體檢測方法中所使用的引物探針序列進行順序拼接重組而構(gòu)成的陽性重組質(zhì)粒能夠以幾十至數(shù)百元的成本，在十幾天的周期內(nèi)就獲得任一檢測方法所需要的陽性物質(zhì)。且這種陽性物質(zhì)具有高度的方法專一性，對于不同檢測方法間不會產(chǎn)生污染，并且能夠通過序列設(shè)計在每種陽性質(zhì)粒中插入獨立標(biāo)記序列，實現(xiàn)陽性結(jié)果的可識別可追溯。此外，通過對特定檢測標(biāo)準(zhǔn)方法建立對應(yīng)的陽性質(zhì)粒，可以有效幫助標(biāo)準(zhǔn)方法的實施，促進檢測工作標(biāo)準(zhǔn)化的進行。

3.2?存在的問題及改進方向

首先，實際工作應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)先進行重組序列的構(gòu)造設(shè)計，每一個陽性序列可以按照上游引物序列、探針序列、下游引物反向互補序列的順序拼接在一起。當(dāng)需要設(shè)計多個序列時可以直接拼接，還可以對不同重組序列片段進行比較，將序列末端相同的若干基因序列進行壓縮堿基拼接，以達(dá)到減小片段長度的目的。

其次，在序列合成時，可以根據(jù)檢測的需求，對于陽性序列的獲得采用不同的方式：對于70 bp以下可以考慮直接化學(xué)合成，對于70～200 bp可以考慮通過搭橋PCR的方式多次拼接，對于200 bp以上的多元陽性重組可以采用全基因合成的方式。但由于100 bp以下的oligoDNA片段在試驗操作中較容易產(chǎn)生氣溶膠，對于試驗空間、試驗條件、試驗操作較為有限的實驗室會有較大的風(fēng)險形成陽性氣溶膠污染[9]，通過將陽性序列分解為不具備完整擴增產(chǎn)物的片段進行搭橋PCR連接能夠更好地避免污染。如果出于操作流程和防污染的角度出發(fā)，將5～12個陽性重組序列進行拼接構(gòu)建一個長片段進行全基因合成能夠更加方便快捷，成本也更低。

第三，在3類陽性對照組中，陽性對照的主要功能是確保擴增體系溶液配制正確，溶液中不含抑制擴增反應(yīng)的成分，重組陽性質(zhì)粒能完全勝任陽性目標(biāo)DNA對照、PCR抑制對照組的功能。但是陽性提取對照僅能使用陽性樣品或陽性基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對照品。設(shè)立陽性提取對照的目的是確保在DNA提取過程中保障模板DNA提取的質(zhì)量，確保被測目標(biāo)基因序列不因提取方法的不當(dāng)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。但一般的實時熒光PCR檢測方法中都會加入內(nèi)源基因的檢測組，通過內(nèi)源基因Ct值的大小限制確保樣品DNA模板提取的濃度滿足檢測需求，這在很大程度上就足以代替陽性提取對照組的功能。

第四，由于引物探針序列重組陽性質(zhì)粒本身并不是目標(biāo)擴增的全長片段，通常情況下會略短于全長片段，因此與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比可能存在影響擴增效率的潛在因素。但出于常規(guī)實時熒光PCR引物探針設(shè)計原則[10]，其擴增片段長度與引物探針區(qū)間序列不應(yīng)對擴增結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此重組序列應(yīng)當(dāng)能滿足大多數(shù)定性檢測方法的需求。

第五，對于實時熒光定量PCR而言，重組質(zhì)粒與目標(biāo)擴增的全長片段在擴增效率上的影響需要更進一步的定量分析，未經(jīng)驗證的重組質(zhì)?？赡懿粦?yīng)直接用于定量檢測結(jié)果的分析，以避免重組序列構(gòu)建對定量結(jié)果的不確定性影響。

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