白細(xì)胞殘留量檢測(cè)方法的改進(jìn)

胡海軍

【摘要】 目的 對(duì)白細(xì)胞殘留量檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)， 令結(jié)果更準(zhǔn)確， 操作更快速。方法 利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀使用的溶血素替代結(jié)晶紫染色液， 然后利用大容量 Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

結(jié)果 無需提前配置試劑， 試驗(yàn)操作時(shí)間短， 溶血素對(duì)白細(xì)胞影響小， 對(duì)紅細(xì)胞和血小板溶解充分， 無背景的干擾， 令檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。結(jié)論 利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀使用的溶血素替代結(jié)晶紫染色液， 能夠提高白細(xì)胞殘留量的檢測(cè)準(zhǔn)確度和檢測(cè)速度。

【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞殘留量;溶血素;結(jié)晶紫染色液

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.33.103

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展， 臨床成分輸血治療日益擴(kuò)大， 人們對(duì)血液質(zhì)量、輸血治療和輸血安全提出了更高層次的要

求[1]。目前的科學(xué)技術(shù)手段并不能制造出人造血液， 因此臨床用血只能選擇采集健康人體的血液， 輸血治療被廣泛的應(yīng)用于外傷性失血、嚴(yán)重?zé)齻a(chǎn)后大出血以及各種大型手術(shù)等。輸血技術(shù)在不斷的發(fā)展， 臨床常采用濾除白細(xì)胞后的血液制品作為主要的輸血產(chǎn)品。白細(xì)胞是血液中的主要成分之一， 其主要功能是防御作用， 根據(jù)種類可分為中性粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞等， 根據(jù)種類的不同以不同的方式參與機(jī)體的防御反應(yīng)， 例如中性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的吞噬性， 能夠?qū)η秩霗C(jī)體的微生物病原體進(jìn)行吞噬， 然后再進(jìn)行自身降解， 并釋放出多種溶酶體酶類以溶解其周圍組織形成膿液， 最后達(dá)到清除微生物病原體的作用。而在輸血中， 白細(xì)胞是導(dǎo)致多種非溶血性發(fā)熱性發(fā)熱反應(yīng)的主要因素， 因此在臨床的輸血過程中， 所選取的多為濾去大部分白細(xì)胞之后的血液制品， 使用去白細(xì)胞血液產(chǎn)品能夠有效的降低非溶血性發(fā)熱性發(fā)熱反應(yīng)、急性肺損傷、輸血相關(guān)性移植物抗宿主病以及人白細(xì)胞抗原系統(tǒng)（HLA）同種免疫等不良反應(yīng)的發(fā)生率， 去除白細(xì)胞可有效避免白細(xì)胞代謝產(chǎn)物引起的各種輸血反應(yīng)已得到證實(shí)[2]， 《全血及成分血質(zhì)量要求》GB 18469-2012已于2012年7月1日實(shí)施， 其中明確規(guī)定了各種成分血的白細(xì)胞殘留量的標(biāo)準(zhǔn)。《血站技術(shù)操作規(guī)程》2012版中附錄F9.1， 已提供推薦的白細(xì)胞殘留量的檢測(cè)方法， 即自行配制結(jié)晶紫染色液與待測(cè)樣本一定比例混合， 然后用大容量 Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤在顯微鏡下計(jì)數(shù)。該方法經(jīng)過實(shí)際工作驗(yàn)證， 發(fā)現(xiàn)存在一些不足， 比如每次試驗(yàn)需要配制試劑， 操作繁瑣， 而且冰醋酸對(duì)紅細(xì)胞及血小板的溶解不充分， 過多的殘?jiān)绊懓准?xì)胞的計(jì)數(shù)， 結(jié)晶紫的染色效果也不佳等情況， 也直接影響白細(xì)胞的計(jì)數(shù)。為此， 作者設(shè)計(jì)了試驗(yàn)， 對(duì)白細(xì)胞殘留量的檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)， 取得了良好的效果， 檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司生產(chǎn)的溶血素， 批號(hào)：18080672。

1. 2 儀器 德國進(jìn)口大容量 Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤;奧林巴斯顯微鏡。

1. 3 方法

1. 3. 1 操作 50 μl血液標(biāo)本加入450 μl溶血素中， 充分混勻。在Nageotte計(jì)數(shù)池中加入上述混合液， 將計(jì)數(shù)池置于帶蓋潮濕容器中， 于室溫放置5 min。在200倍顯微鏡下對(duì)計(jì)數(shù)池中兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)（每區(qū)有20個(gè)長方形格）的白細(xì)胞計(jì)數(shù)， 40行相當(dāng)于50 μl。

1. 3. 2 計(jì)算 白細(xì)胞數(shù)/μl=2個(gè)區(qū)域白細(xì)胞計(jì)數(shù)和×10/50 μl，

公式中：10為稀釋倍數(shù)， 50 μl為計(jì)數(shù)池2個(gè)區(qū)的容積。每袋中殘留白細(xì)胞數(shù)按下列公式計(jì)算：殘留白細(xì)胞數(shù)/袋=白細(xì)胞數(shù)/μl×去白細(xì)胞血液容量（ml）×1000。

2 結(jié)果

推薦方法中的結(jié)晶紫儲(chǔ)存液配置的保存期為6個(gè)月， 使用液每次現(xiàn)用現(xiàn)配且需要利用0.22 μm過濾器過濾， 改進(jìn)的方法無需提前配置試劑， 溶血素的保存期一般為1年， 且血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為血站非常普及的儀器設(shè)備， 容易直接獲得溶血素， 試驗(yàn)操作時(shí)間短， 溶血素對(duì)白細(xì)胞影響小， 對(duì)紅細(xì)胞和血小板溶解充分， 無背景的干擾， 方便顯微鏡下的人工計(jì)數(shù)， 令檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

3 討論

目前， 臨床的用血量仍在不斷的增加， 輸血醫(yī)學(xué)也在不斷的發(fā)展中， 人們對(duì)于輸血引發(fā)的不良反應(yīng)以及并發(fā)癥危害的關(guān)注程度也越來越高， 如何在合理應(yīng)用血液資源的同時(shí)盡量減少因輸血引發(fā)的一系列不良反應(yīng)是目前輸血界與臨床醫(yī)療部門所共同關(guān)注的熱點(diǎn)話題。當(dāng)前已經(jīng)確認(rèn)血液中的白細(xì)胞是引發(fā)輸血嚴(yán)重不良反應(yīng)的主要原因。白細(xì)胞是人體免疫機(jī)制的重要細(xì)胞種類， 主要為粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞三個(gè)種類， 在病菌侵襲人體時(shí)， 白細(xì)胞能夠通過變形以穿過毛細(xì)血管壁并在病菌入侵部位聚集， 對(duì)病菌進(jìn)行包圍后吞噬， 從而達(dá)到清除病菌的目的， 因此， 血清白細(xì)胞數(shù)量增高提示可能有炎癥發(fā)生。白細(xì)胞一般在組織中發(fā)揮作用， 其可以伸出偽足進(jìn)行變形運(yùn)動(dòng)從毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的間隙擠出并進(jìn)入血管周圍組織內(nèi)， 之后通過變形運(yùn)動(dòng)在組織內(nèi)進(jìn)行游走， 找到病原體或組織碎片并吞噬， 從而參與對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)控。

白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高一般分為病理性和生理性， 病理性升高的最常見病因?yàn)楦腥荆?但老年患者由于反應(yīng)性較低， 因此在發(fā)生感染時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高不明顯;生理性升高常見劇烈運(yùn)動(dòng)、飽餐、情緒緊張以及妊娠末期等。白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低的常見原因?yàn)椴《靖腥荆?如水痘、流行性感冒以及病毒性肝炎等。因此， 臨床在對(duì)患者進(jìn)行血常規(guī)檢查時(shí)， 常需要對(duì)血清中的白細(xì)胞含量進(jìn)行計(jì)數(shù)以為臨床診斷提供一定的依據(jù)， 而在血站則需要檢測(cè)白細(xì)胞的殘留量以避免白細(xì)胞代謝產(chǎn)物引起的各種輸血反應(yīng)， 同時(shí)臨床輸血也已將濾除白細(xì)胞的血液或少白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞作為主要的血液制品選擇。

去白細(xì)胞血液產(chǎn)品的白細(xì)胞殘留量的控制質(zhì)量具有非常重要的意義， 若不濾去懸浮紅細(xì)胞液中的白細(xì)胞， 那么大量的白細(xì)胞在被輸入到患者的體內(nèi)后會(huì)對(duì)其造成較大的代謝負(fù)擔(dān)， 從而可能導(dǎo)致患者發(fā)生非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)， 不利于患者的機(jī)體健康與疾病的治療[4， 5]。常用的檢測(cè)白細(xì)胞殘留量的方法為流式細(xì)胞儀與Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)兩種。流式細(xì)胞儀是一種具有穩(wěn)定、有效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)方法， 但所需的設(shè)備以及檢測(cè)費(fèi)用均較為昂貴， 不利于在臨床廣泛應(yīng)用。而若是按照我國目前規(guī)定的使用Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)， 則所需的計(jì)數(shù)時(shí)間較長且檢測(cè)樣品的過程較為復(fù)雜， 在較短時(shí)間內(nèi)只能檢測(cè)有限量的樣品， 因此反應(yīng)產(chǎn)品的情況就受到了一定的局限。目前所公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)為濾除后血液的白細(xì)胞數(shù)量降低至5×108個(gè)/L時(shí)即可避免因白細(xì)胞抗體所導(dǎo)致的非溶血性發(fā)熱性輸血反應(yīng)（FNHTRs）， 當(dāng)殘留的白細(xì)胞數(shù)<5×107個(gè)/L時(shí)可有效降低輸血后移植物抗宿主病的危險(xiǎn)， 當(dāng)殘留的白細(xì)胞數(shù)<5×106個(gè)/L時(shí)可有效預(yù)防HLA抗體所導(dǎo)致的同種免疫以及與白細(xì)胞攜帶病毒相關(guān)疾病的傳播[6， 7]。影響濾除后血液中白細(xì)胞數(shù)量的因素有白細(xì)胞濾器的選擇、過濾前全血的保存時(shí)間、過濾前血液是否混勻以及白細(xì)胞濾除過程時(shí)間的長短等。

對(duì)白細(xì)胞殘留量檢測(cè)方法的改進(jìn)， 一定程度上提高了準(zhǔn)確度和檢測(cè)速度， 但在實(shí)際工作中， 手工操作很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作， 重復(fù)性差， 給檢測(cè)結(jié)果帶來誤差， 并且操作繁瑣， 費(fèi)時(shí)長。目前來說， 如果用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來檢測(cè)去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞中的白細(xì)胞殘留量， 顯然靈敏度不夠， 因?yàn)檠?xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)的對(duì)象都是正常人群及患病人群的血液， 稀釋比例也是按照這個(gè)濃度來設(shè)計(jì)的， 試想一下， 如果血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀廠家， 能夠根據(jù)血站的需要， 對(duì)程序稍加改動(dòng)， 針對(duì)成分血液的特點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的稀釋模式， 從而來完成各種成分血的血細(xì)胞計(jì)數(shù)， 就能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作， 重復(fù)性和準(zhǔn)確度會(huì)大大提高， 且人為因素干擾小。屆時(shí)， 率先實(shí)現(xiàn)這一功能的廠家一定會(huì)在血站占有一定的市場(chǎng)。

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[收稿日期：2019-03-25]