發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦喂養(yǎng)中的應用研究

馬仁勝　高常年　鮑俊杰　王永杰

摘要? [目的]優(yōu)化植物源蛋白發(fā)酵飼料的生產工藝，探討發(fā)酵飼料替代傳統(tǒng)膨化飼料飼養(yǎng)克氏原螯蝦的可能性。[方法]以小肽含量為指標，對枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個菌種的混合發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，并用該工藝條件生產的發(fā)酵飼料來飼養(yǎng)克氏原螯蝦。[結果]枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個菌種混菌發(fā)酵最佳工藝條件為接種量15%、固液比2∶1（g∶mL）、發(fā)酵時間96 h、溫度32 ℃，且接種枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌的比例為 12∶3∶2;原料經過混合菌發(fā)酵后，小肽含量提高了約10倍，粗纖維含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。采用發(fā)酵飼料喂養(yǎng)的克氏原螯蝦，在生長初期增重速率明顯高于投喂膨化飼料的，發(fā)酵飼料組蝦田水體pH和溶氧都略低于膨化飼料組，氨氮對比差異不明顯。[結論]發(fā)酵飼料更易于克氏原螯蝦生長初期消化吸收，可部分代替膨化飼料使用，且對水質影響較小。

關鍵詞? 克氏原螯蝦;混菌發(fā)酵;發(fā)酵飼料;水質

中圖分類號? S966.12??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.037

Study on the Application of Fermented Feed in the Feeding of Crayfish

MA Ren-sheng1，GAO Chang-nian2，BAO Jun-jie3 et al

（1.Feixi Animal Disease Prevention and Control Center，Hefei， Anhui 231200;2.Feixi Jiayu Ecological Agriculture Technology Co.， Ltd.，Hefei， Anhui 231200;3.Fisheries Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei， Anhui 230031）

Abstract? [Objective]To optimize the production process of plant-derived protein fermented feed and explore the possibility of fermented feed replacing traditional extruded feed for crayfish.[Method]The mixed fermentation conditions of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were optimized by using small peptide content as indicators. The fermented feed produced by the process conditions was used to raise crayfish. [Result]The optimal fermentation conditions for the mixed fermentation of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were as follows： inoculum 15%， solid-liquid ratio 2∶1（g∶mL）， fermentation time 96 h， temperature 32 ℃， and that inoculation proportion with Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast was 12∶3∶2. After fermentation of the mixed bacteria， the content of small peptides increased about 10 times， slight decreased in the content of crude fiber and no significant change in the contents of crude protein， crude ash and crude fat. The growth rate of crayfish fed with fermented feed was significantly higher than that fed with extruded feed in the early stage of growth. The pH and dissolved oxygen of the shrimp field in the fermented groups were slightly lower than those in the extruded groups. No significant differences were found in ammonia and nitrogen. [Conclusion]Fermented feed is easier to be digested and absorbed in the early growth stage of crayfish， which can partially replace extruded feed， and it has little effect on water quality.

Key words? Crayfish;Mixed fermentation;Fermented feed;Water quality

基金項目? 肥西縣科技特派員專項。

作者簡介? 馬仁勝（1965—），男，安徽合肥人，副研究員，碩士，從事水產養(yǎng)殖研究。

收稿日期? 2019-11-07

大豆、花生等植物提取油類后的副產物蛋白質含量較高，氨基酸組成合理，價格便宜且資源豐富[1-2]。但由于其含有多種抗營養(yǎng)因子、氨基酸不平衡、功能性營養(yǎng)物質缺乏且適口性較差，不適合直接用于飼喂動物[3-6]。如何提高豆粕和花生粕等植物蛋白源的飼用價值，受到越來越多學者的關注。

常見的發(fā)酵飼料是由玉米、大豆和花生等通過微生物發(fā)酵后干燥壓制而成。其蛋白含量與傳統(tǒng)飼料相近，有利于降低水產動物飼喂的成本，提高養(yǎng)殖收益。筆者擬優(yōu)化枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌協(xié)同發(fā)酵雜粕的生產工藝，并初步探究飼喂發(fā)酵飼料對克氏原螯蝦生長以及水質情況的影響，旨在為生物發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中的實際應用提供參考[7-9]。

1? 材料與方法

1.1? 材料與菌種

豆粕和玉米粕：由安徽萬士生物制藥有限公司提供，粉碎過40目篩;

無菌水：蒸餾水分裝，121 ℃ 滅菌 20 min;

枯草芽孢桿菌：由實驗室分離所得;

植物乳酸菌：購自安徽萬士生物制藥有限公司;

釀酒酵母菌：購自安徽萬士生物制藥有限公司。

1.2? 培養(yǎng)基配制

1.2.1? 液體種子培養(yǎng)基配制。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調pH至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：酵母膏5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、檸檬酸氫二胺2 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 g、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.6 g、硫酸錳0.2 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調pH至6.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2? 發(fā)酵種子液的制備。

首先將枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌接于各菌種的液體種子培養(yǎng)基中，分別為LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基。將枯草芽孢桿菌置于35 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，釀酒酵母菌置于30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，乳酸30 ℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，將上述菌液按1%的接種量分別接種到各菌種的液體種子培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)。

1.3? 混菌發(fā)酵雜粕試驗設計

1.3.1? 混菌發(fā)酵雜粕菌種比例優(yōu)化。

采用正交試驗設計，將3個菌種分別以不同接種量進行3因素3水平正交試驗，每組設定重復。

發(fā)酵條件為溫度32 ℃、固液比2∶1（g∶mL）、發(fā)酵時間48 h、pH 70。以發(fā)酵結束產的小肽含量為考察指標，確定3菌種混合發(fā)酵時的最佳比例?；炀l(fā)酵雜粕的菌種接種比例的正交試驗設計如表1所示。

1.3.2? 混菌發(fā)酵雜粕條件的優(yōu)化。

在確定3個菌種的最佳接種比例的基礎上，采用正交試驗設計，對混菌發(fā)酵雜粕的接種量（A）、固液比（B）、發(fā)酵時間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個因素進行優(yōu)化，每個因素設3個水平，進行4因素3水平正交試驗。優(yōu)化混菌發(fā)酵條件的正交試驗設計如表2所示。

1.4? 測定方法

發(fā)酵結束后，將發(fā)酵產物于烘箱中45 ℃烘至恒重，靜置24 h，然后粉粹過60目篩，進行指標測定。小肽含量測定參照輕工行業(yè)標準《大豆肽粉》（QB/T2653—2004）中方法;粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法;粗脂肪含量測定采用索氏抽提法;水質測定采用YSI多參數水質測定儀。

1.5? 數據統(tǒng)計與分析

數據用Excel進行初步處理后，做統(tǒng)計分析，其中正交數據采用一般線性模型單變量進行極差與方差分析，其他采用單因素方差分析。

1.6? 田間飼喂管理

7—9月，在肥西縣稼漁水產有限公司基地的5#～8#稻蝦共生池塘比較不同飼料的功效。同樣水源情況下，池塘面積均為0.33～0.47 hm2，放養(yǎng)蝦苗體重為5～7 g，放養(yǎng)密度8尾/m2，養(yǎng)殖周期90 d。5#、6#僅投喂發(fā)酵飼料，7#、8#僅投喂傳統(tǒng)膨化飼料，日投喂量約為蝦體重4%。每10 d從試驗的各個稻蝦塘隨機撈取20尾克氏原螯蝦樣本測量總體重，并測量水體溶解氧、pH、氨氮。

2? 結果與分析

2.1? 混菌發(fā)酵菌種比例試驗結果

由正交試驗結果（表3）可知，3個菌種對發(fā)酵雜粕產小肽的影響程度為 A>B>C，即枯草芽孢桿菌對發(fā)酵產肽的貢獻最大，其次是乳酸菌，酵母菌對發(fā)酵效果的貢獻最小。方差分析結果顯示，3個菌種對發(fā)酵產物中小肽含量均沒有顯著影響（P>0.05）。此次試驗中枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵雜粕的最佳接種比例為A3B3C2，即混菌發(fā)酵的菌種比例為枯草芽孢桿菌∶乳酸菌∶酵母菌=12∶3∶2。

2.2? 混菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化試驗結果

由正交試驗結果（表4）可知，4種因素對發(fā)酵產肽的影響程度為 A>C>D>B，即接種量對發(fā)酵產肽的影響最大，其次是發(fā)酵時間，固液比和溫度對發(fā)酵效果的影響較小。方差分析結果顯示，接種量和發(fā)酵時間對發(fā)酵產物中小肽含量有顯著影響（P<0.05）。結合k值大小分析可得，3個菌種混合發(fā)酵豆粕工藝條件的最佳組合為A2B3C3D2，即在接種量為15%、固液比為2∶1、發(fā)酵時間為96 h、溫度為32 ℃的條件下，可以取得最優(yōu)發(fā)酵效果。

2.3? 雜粕發(fā)酵前后理化性質變化

雜粕發(fā)酵前后主要營養(yǎng)物質含量發(fā)生變化，小肽、粗蛋白、粗纖維、灰分和粗脂肪的含量（相對干物質）變化如表5所示。雜粕經混菌發(fā)酵后，小肽含量變?yōu)?7.92%，顯著高于未發(fā)酵組;粗纖維含量有所降低;粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。

2.4? 不同飼料飼喂克氏原螯蝦生長的結果

從蝦苗投放開始計，每10 d從試驗的各個稻蝦塘隨機撈取20尾樣本測量總體重。由表6可以看出，投喂發(fā)酵飼料一組的蝦在生長初期體重增長速率明顯高于投喂膨化飼料一組的蝦。但從蝦的生長中期開始，膨化飼料組蝦的增重速率就開始超過發(fā)酵飼料組。

2.5? 水質監(jiān)測結果

從蝦苗投放開始，每10 d對水體的溶解氧、pH、氨氮進行測量，試驗結果如表7所示。由表7可以得到，發(fā)酵飼料組蝦田pH和溶解氧都低于膨化飼料組，2組試驗蝦田的氨氮對比差異不明顯。

3? 討論

混菌發(fā)酵雜粕試驗表明，發(fā)酵前后營養(yǎng)物質含量存在較明顯變化。該試驗中原料經3種微生物混合發(fā)酵處理后，小肽含量較未發(fā)酵前提高了約10倍，但前后的粗蛋白質含量變化不顯著。小肽含量的升高是因為微生物發(fā)酵可以把豆粕中的蛋白質水解為氨基酸、多肽等小分子物質[10-12]。同時蛋白質含量變化不大，說明發(fā)酵過程中微生物雖然消解了部分植物蛋白，但同時有新的蛋白質產出，可能是菌體發(fā)酵過程中轉化而成的。可見在發(fā)酵過程中，微生物繁殖時能將豆粕中不易消化的植物蛋白質轉化為菌體蛋白，改良了豆粕中蛋白質的品質[13-15]。

飼喂試驗中，發(fā)酵飼料組的克氏原螯蝦在生長初期重量增長速率較快，可能是因為飼料中含有的發(fā)酵菌進入幼蝦的消化道輔助消化，進而促進蝦的生長。豆粕經發(fā)酵水解后產生的小分子蛋白、小肽也便于蝦的消化利用[16-17]。并且發(fā)酵飼料所用的菌體在貯存期仍然繼續(xù)繁殖發(fā)酵，使飼料產品具有香味進而有較好的誘食性。但當克氏原螯蝦達到生長中期，膨化飼料組蝦的增重速率就開始超過發(fā)酵飼料組，可能是因為發(fā)酵飼料質地松散，投入水中容易消散，大體格蝦覓食時難以發(fā)現成塊飼料，影響攝食，導致增重緩慢。

飼喂2種飼料對水質的影響差異不明顯。發(fā)酵飼料組含氧量略低，可能因為飼料中含有較多微生物，增加了額外的氧氣消耗。氨氮及pH都較為穩(wěn)定，沒有出現壞水情況。

4? 結論

（1）通過研究表明，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌3個菌種的混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕最佳工藝條件為接種量15%、固液比2∶1、發(fā)酵時間96 h、溫度32 ℃，且混合菌中枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌的比例為 12∶3∶2。

（2）豆粕經過混合菌發(fā)酵后，大分子蛋白質被降解，小肽含量提高了約10倍，粗纖維含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量變化不明顯。

（3）用混合菌發(fā)酵飼料飼喂克氏原螯蝦，蝦在生長初期重量增長速率明顯高于投喂膨化飼料一組的蝦，可以考慮在克氏原螯蝦養(yǎng)殖前期替代發(fā)酵飼料使用，使用發(fā)酵飼料對水質的影響與膨化飼料相比，差異不大。

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