地錦草與5種抗菌藥聯(lián)用對豬鏈球菌的體外抑菌效果

江超　姚飛虹　張之怡　程慶　羅稀楷　李嗣忻　舒宇　王歧本

摘要? [目的]探究地錦草與其他抗菌藥物對豬鏈球菌的體外聯(lián)合抗菌效果，達到有效防止豬鏈球菌的目的。[方法]采用瓊脂稀釋法、微量肉湯棋盤稀釋法，分別測定了地錦草與慶大霉素、青霉素、頭孢曲松、阿莫西林、硫酸鏈霉素對3株豬鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）及分級抑菌濃度指數(shù)（FIC）。[結(jié)果]地錦草和5種抗菌藥聯(lián)用后對3株鏈球菌的MIC有不同程度的降低，聯(lián)用后都表現(xiàn)為相加或協(xié)同效果。[結(jié)論]地錦草在體外與5種抗菌藥聯(lián)用可減少抗菌藥物用量，增強藥物對細菌的抑制作用。

關(guān)鍵詞? 地錦草;抗菌藥物;體外聯(lián)合藥敏試驗;豬鏈球菌

中圖分類號? S853.7??? 文獻標(biāo)識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0114-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.034

Antibacterial Effect of Euphorbia humifusa Combining with Five Antimicrobials against Streptococcus suis in vitro

JIANG-Chao1，YAO Fei-hong2，ZHANG Zhi-yi1 et al

（1.The Basic Medical College of Xiangnan University，Chenzhou，Hunan? 423000;2.Pharmacy College of Xiangnan University，Chenzhou，Hunan? 423000）

Abstract? [Objective]In order to effectively prevent Streptococcus suis，? Euphorbia humifusa combining with five antimicrobials against S. suis in vitro was studied. [Method]The classical agar dilution method and micro broth checkerboard dilution method were used， the sensitivity effects of Euphorbia humifusa combining with gentamicin，streptomycin sulfate，penicillin，ceftriaxone，amoxicillin againsts three serotypes S. suis were tested in vitro，the minium inhibitor concentration（MIC）and the fractional inhibitory concentration（FIC） were calculated.[Result]After combining， the MIC of the Euphorbia humifusa and the five kinds of antibacterials to the three strains of S. suis had different degrees of reduction， the combined effect was additive or synergistic.[Conclusion]It is suggested that the combination of five kinds of antibacterial with Euphorbia humifusa in vitro can reduce the antibacterial drugs and enhance the inhibitory effect of drugs on bacteria.

Key words? Euphorbia humifusa;Antimicrobials;Combined susceptibility test in vitro;Streptococcus suis

基金項目? 湖南省教育廳科研項目（2015C1286，2016C1492）;湘南學(xué)院2018學(xué)年校級實驗室開放項目（27）;湖南省普通高等學(xué)校重點實驗室湘南學(xué)院心腦血管天然藥物研究實驗室項目（XN2017K05）。

作者簡介? 江超（1982—），女，湖南株洲人，碩士，從事藥理與毒理研究。 *通信作者，教授，碩士，從事微生物學(xué)研究。

收稿日期? 2019-08-19;修回日期? 2019-08-30

抗生素是常用的一種藥物，但是隨著抗生素的濫用與亂用，耐藥菌株也越來越多地出現(xiàn)，同時抗生素的殘留和副作用使得抗生素的使用令人堪憂。近年來，隨著人們對健康環(huán)保意識的增強，中藥研究成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，中藥中的許多成分如有機酸、生物堿、黃酮類、苯醌等成分都有一定的抗菌作用，且中藥具有低殘留、不易誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[1-4]，但是由于中藥的抑菌活性比較小、應(yīng)用成本高、療效比較慢的缺點使得其在臨床應(yīng)用中受到了一定的制約。中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治細菌性疾病成為現(xiàn)在研究的熱點[5-8]。豬鏈球菌病是一種人畜共患的細菌性疾病，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟損失，也危害公眾健康安全，豬鏈球菌感染人導(dǎo)致人患腦膜炎、眼內(nèi)炎等，其中出現(xiàn)腦膜炎的概率最高，我國曾出現(xiàn)過幾次感染人的事件[9]。地錦草是一種常見的中草藥，具有清熱解毒、抗菌止瀉等作用，關(guān)于地錦草應(yīng)用和抑菌作用的報道比較多，但是關(guān)于地錦草與抗菌藥物聯(lián)用對豬鏈球菌的抑菌作用效果鮮見報道[10-13]。該研究旨在觀察地錦草與抗菌藥物聯(lián)用對臨床分離的豬鏈球菌的體外抑菌效果，以期為臨床合理用藥提供指導(dǎo)，達到有效防治豬鏈球菌病的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株。

豬鏈球菌3株，編號分別為SS2 、SS7 、SSm，分離自郴州地區(qū)某大型豬場。 質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌（編號ATCC49619），購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2? 藥物與試劑。

抗生素：青霉素、頭孢曲松、慶大霉素、阿莫西林、硫酸鏈霉素均為國產(chǎn)藥，市購，按《中華人民共和國藥典》要求鑒定合格，使用時均在有效期內(nèi)。

中藥：地錦草，自采，按《中華人民共和國藥典》要求鑒定合格。

培養(yǎng)基：腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基（brain heart infusion broth，BHI）（批號：20181126）、瓊脂粉（批號：20190322）、小牛血清（購自杭州四季青生物工程材料有限公司）。

1.1.3? 主要儀器設(shè)備。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）;恒溫恒濕培養(yǎng)箱;電熱鼓風(fēng)干燥箱;立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠）;AUW120D 型電子天平（日本島津）;微量可調(diào)移液器（德國Eppendorf公司）;SHA-B型水浴恒溫搖床等。

1.2? 方法

1.2.1? 抗菌藥物母液的配制。

用十萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱取適量青霉素、慶大霉素、阿莫西林、硫酸鏈霉素、頭孢曲松，分別配制成濃度為2 560 μg/mL的母液50 mL，過濾除菌，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 地錦草水提液的制備。

稱取地錦草干燥粉末20 g，加入200 mL蒸餾水，浸泡30 min后煮沸，煎煮計時30 min，在煎煮過程中要注意攪拌，煎煮3次，每次煎得的藥液和藥渣都用紗布趁熱過濾，合并3次濾液后，濃縮至生藥濃度為1 g/mL，即為地錦草水提液。過濾除菌，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3? 菌懸液的制備。

將菌種從-80 ℃冰箱中取出，在超凈工作臺中用接種環(huán)劃線接種于含5%小牛血清腦心浸出液的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h;觀察菌落的形態(tài)特點，挑取單個菌落接種到腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h;調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，使用時用生理鹽水進行稀釋。

1.2.4? 單獨用藥時最小抑菌濃度（MIC-single，簡寫MIC-s）的測定（瓊脂稀釋法）[14]。

分別測定地錦草提取液、青霉素、硫酸鏈霉素、頭孢曲松、慶大霉素、阿莫西林對3株豬鏈球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitoty concentration，MIC）。

分別取2 mL對倍稀釋的上述抗生素溶液加入18 mL滅菌的含5%新生小牛血清的BHI瓊脂培養(yǎng)基（注意培養(yǎng)基溫度冷卻至50 ℃），混勻后倒入平板，冷卻，各藥物設(shè)置15個濃度（最終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0125、0.062 5、0.031 25 、0.015 6 μg/mL）。每個濃度3個重復(fù)，將麥?zhǔn)媳葷岫葹?.5的菌液用生理鹽水稀釋100倍后，用微量移液器吸取1～2 μL菌液接種于已制備好的含藥平板表面，待菌液吸收后置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，以無菌生長（單個菌落忽略不計）的最低濃度為該藥單獨用藥時的MIC-single。

1.2.5? 聯(lián)合藥敏試驗（微量肉湯棋盤法）[15]。

取96孔無菌微孔板，在方陣的橫列中，將地錦草用滅菌BHI肉湯進行倍比稀釋;在方陣的縱列中，將青霉素用滅菌BHI肉湯進行倍比稀釋，使地錦草和青霉素初始孔的終濃度分別為單獨用藥時MIC的2倍，共稀釋6個濃度，2種藥物的量各為50 μL，最后在無菌微孔板中加入100 μL菌液，使最終菌液濃度為5×105 CFU/mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h（設(shè)3個重復(fù)），觀察結(jié)果。選擇最佳組合效應(yīng)時，2藥聯(lián)合時的各自的MIC（MIC-combined，簡寫MIC-c）。通過計算抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）判斷相互作用。

地錦草與硫酸鏈霉素、阿莫西林、頭孢曲松、慶大霉素的聯(lián)合藥敏方法同青霉素，結(jié)果見表2～4。

FIC=A藥MIC-combined/A藥MIC-single +B藥MIC-combined/B藥MIC-single，F(xiàn)IC指數(shù)≤0.5表示兩藥具有協(xié)同作用;>0.5～1.0表示相加作用;>1.0～2.0表示無關(guān);>2.0表示拮抗作用[15]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 各藥物單獨用藥時的最小抑菌濃度（MIC-s）

由表1可知，地錦草水提液對3株豬鏈球菌都有一定的抑菌作用，MIC為生藥濃度1.25×105 μg/mL，按照郎利敏等[16]介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，處于中度敏感程度（MIC<7.80 mg/mL 為高度敏感，7.80 mg/mL≤MIC<250 mg/mL為中度敏感）。5種抗菌藥物的MIC結(jié)果顯示，3株豬鏈球菌對5種抗菌藥物都不同程度地產(chǎn)生了一些耐藥，有些菌株還產(chǎn)生了多重耐藥。

2.2? 地錦草與5種抗菌藥物對豬鏈球菌的體外聯(lián)合抑菌試驗結(jié)果

由表2～4可知，聯(lián)合藥敏試驗的FIC在0.5～1.0，屬于相加或協(xié)同作用，其中地錦草與頭孢曲松的聯(lián)合效果為協(xié)同，其余為相加。聯(lián)合用藥后藥物的MIC值較單獨用藥時的MIC值都有不同程度的降低，地錦草聯(lián)合用藥后的MIC為單獨用藥的1/4～1/2，5種抗菌藥物聯(lián)合用藥后的MIC為單獨用藥時MIC的1/8～1/2。

3? 結(jié)論與討論

（1）地錦草是一種常見的中草藥，有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，關(guān)于地錦草的抗菌作用研究報道很多，賈艷華等[8]測定地錦草水提液對雞致病性大腸桿菌的最小抑菌濃度為7.813～31.250 mg/mL;嚴(yán)晗光等[17]測定地錦草水提液對豬源性致病性大腸桿菌的最低抑菌濃度為62.5 mg/mL，這與該試驗結(jié)果基本一致，中藥的藥物劑量要遠遠大于西藥的藥物劑量。該試驗選取的5種抗菌藥物是臨床常用的抗菌藥，試驗結(jié)果提示目前豬鏈球菌的耐藥形勢比較嚴(yán)重，因此一旦確診為該菌感染，應(yīng)通過藥敏試驗進行選藥，不能盲目用藥。

（2）中藥和抗菌藥物聯(lián)用后具有取長補短的作用，大量試驗證明中藥和抗菌藥物聯(lián)用后，抗菌藥物的使用量都得到大幅度的降低，從而減少了藥物對機體的毒副作用，同時又克服了中藥單獨用藥的缺陷。潘任桃等[7]將茶皂素與4種抗菌藥物聯(lián)用，測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，聯(lián)合用藥時4種抗菌藥物的MIC為單獨用藥時的1/32～1/4。關(guān)于中藥增強抗菌藥物療效的機制有文獻報道說可能是中藥成分中的一些具有表面活性的物質(zhì)加大了抗菌藥物與細菌接觸的表面積，提高了抗菌藥物的有效濃度或是中藥對細菌造成的氧化性損傷增強了病原菌對抗菌藥物的敏感性[7]。也有資料報道說中藥和西藥聯(lián)用后，中藥可影響后者的體內(nèi)過程，如茵陳浸膏可促進灰黃霉素的吸收，枳實可提高膽道慶大霉素的濃度[18]等，中西結(jié)合抗菌機理還有待進一步的研究。但是并不是中藥和抗菌藥物聯(lián)用后都能起到協(xié)同或相加的作用，賈艷華等[8]通過試驗發(fā)現(xiàn)地錦草與恩諾沙星、黏菌素等藥物聯(lián)用后會產(chǎn)生拮抗作用，在臨床使用聯(lián)合藥物時不能盲目亂用。

（3）該試驗選用的3株菌均為臨床分離的菌株，其中的2型豬鏈球菌為人畜共患的致病菌，地錦草與抗菌藥物聯(lián)用后顯示出很好的效果，它可以提高療效，降低抗菌藥物的用量，減少毒副作用，擴大應(yīng)用范圍，并能發(fā)揮單獨使用中藥或抗菌藥所不能取得的治療作用。但是該試驗只是在體外試驗，在體內(nèi)是否有抗菌作用還是一個未知數(shù)，要使其真正應(yīng)用于臨床，必須結(jié)合體外體內(nèi)的綜合效益評價，建立更準(zhǔn)確有效的檢測系統(tǒng)，確保藥物安全和有效。

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