青藏高原放牧家畜小腸結腸炎耶爾森氏菌LAMP檢測方法的建立及應用

蔡其剛　唐一波　高小龍　仝麗娜　趙靜　張紅見

摘要? 為了建立特異性、敏感性和適用性強的LAMP檢測方法，采用分子生物學方法，根據GenBank數據庫中該細菌的outL基因，進行了多序列比對和保守區(qū)域確定。根據其保守序列，在線設計和篩選了一套LAMP引物。溫度優(yōu)化及特異性和敏感性驗證后建立了檢測該病菌的LAMP檢測方法，并對青藏高原放牧牛、羊臨床糞便樣品進行了檢測。結果表明，LAMP檢測方法的最適溫度為63 ℃;檢測其與大腸桿菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌及蠟樣芽胞桿菌無交叉反應;檢測下限為100 fg目的基因;利用建立的方法檢測了208份放牧牦牛、藏羊糞便DNA樣品，共檢測到26份陽性樣品，陽性率為12.5%。這表明成功建立了一種檢測該病的特異性、敏感性和適用性強的LAMP檢測方法。

關鍵詞? 放牧家畜;小腸結腸炎耶爾森氏菌;LAMP;outL基因;敏感性;特異性

中圖分類號? S852.6??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0107-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.032

Establishment and Application of LAMP Detection Method for Yersinia enterocolitica in Grazing Livestock in Qinghai-Tibet Plateau

CAI Qi-gang1，TANG Yi-bo2，GAO Xiao-long2 et al? （1.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining，Qinghai? 810016;2.College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract? In order to establish a LAMP detection method with high sensitivity，specificity and applicability for Yersinia enterocolitica，outL gene sequences of Y.enterocolitica were downloaded from GenBank database to make multiple sequences blast by using molecular biology method.The conserved regions of the gene were determined.Based on the sequences of conserved gene，a set of LAMP primers were designed and screened out online.The LAMP method was established after temperature optimization，sensitivity and specificity verification.The clinical stool samples of grazing cattle and sheep were detected by the LAMP detection method.The results showed that the optimal temperature for LAMP detection method was 63 ℃.There was no cross-reactivity with Escherichia coli，Salmonella，Enterobacter sakazakii，Staphylococcus aureus，Pasteurella multocida and Bacillus cereus. The detection limit was 100 fg of the target gene.26 positive samples were detected among 208 fecal DNA samples of yak and Tibet sheep，the positive rate was 12.5%.These results demonstrated that a LAMP method for the detection of Y.enterocolitica with high sensitivity，specificity and applicability was established.

Key words? Grazing livestock;Yersinia enterocolitica;LAMP;outL gene;Sensitivity;Specificity

基金項目? 國家自然科學基金項目（31560695，31560701）;青海省農牧廳項目（NMSY-2016-07，NMSY-2018-03）。

作者簡介? 蔡其剛（1981—），男，河南商丘人，副研究員，博士，從事動物疫病診斷防治研究。*通信作者，教授，碩士，碩士生導師，從事青藏高原畜禽傳染病的診斷與防治研究。

收稿日期? 2019-06-08

小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）簡稱耶氏菌，是一種革蘭氏陰性菌，能引起人和多種動物的耶氏菌病。在歐洲，該病是常見的第三大食源性細菌性疾病，排在前2位的分別是腸沙門氏菌和空腸彎曲桿菌[1]。大多數情況下，該病都是由耶氏菌感染所致，可導致患病動物產生各種臨床癥狀，如發(fā)燒、腹痛和腹瀉等[2]，在世界范圍內造成了極大的經濟損失。其流行病學尚不清楚，通常認為人感染該病主要是通過食用未煮熟的動物產品或飲用污染了耶氏菌的水而感染[3-5]。環(huán)介導等溫擴增反應（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來發(fā)展較快的一種檢測方法，該方法最大的優(yōu)點是通常在1 h內即可將目的基因擴增到1×109 倍，且操作簡單、快速、敏感性高和特異性強，無需特殊儀器。因此，LAMP方法已被廣泛應用于包括多種細菌、病毒以及寄生蟲等病原的快速檢測研究[6-9]。

為了檢測放牧牦牛、藏羊群中耶氏菌病的感染情況，進而對環(huán)境中該病菌的污染情況和人感染風險進行評估，筆者針對該病菌的outL基因保守序列，綜合利用分子生物學相關技術，建立了LAMP快速檢測方法，并利用建立的LAMP檢測方法，對來自青海省和西藏自治區(qū)的208份放牧牦牛、藏羊糞便樣品進行了檢測。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 標準菌株與對照菌株。

耶氏菌標準菌株（ATCC23715），購自北京中科質檢生物技術有限公司;對照菌株大腸桿菌（E.coli）、沙門氏菌（Salmonella）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）及蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），均由青海大學農學院動物醫(yī)學系獸醫(yī)傳染病學實驗室提供。

1.1.2? 主要試劑及儀器。

1.1.2.1? 試劑。改良磷酸緩鹽沖液（PSB）培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司;細菌基因組快速抽提試劑盒，購自北京艾比根生物技術有限公司;糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、核酸替代染料、6×Loading Buffer、DL-2 000 Marker、2×Taq PCR Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司;Loopamp DNA擴增試劑盒（環(huán)介導等溫擴增法）及Loopamp熒光目視檢測試劑盒，均購自榮研生物科技（中國）有限公司。

1.1.2.2? 儀器。實時濁度儀（型號為LA-320C），購自日本榮研化學株式會社;核酸蛋白測定儀（型號為Bio photometer plus），購自德國Eppendorf公司;核酸電泳儀（型號為DYY-12）購自于北京六一生物科技有限公司;凝膠成像分析系統（型號為6300），購自上海天能科技有限公司。

1.1.3? 引物。

根據NCBI網站中GenBank數據庫登錄的耶氏菌的outL基因（登錄號為CP009846.1），使用生物學軟件MEGA7.0比對outL基因的保守序列，按照LAMP方法的引物設計原則，在線（http：//primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html）設計并篩選針對outL基因的引物序列（表1）。HPLC級引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4? 標準菌株及對照菌株DNA。

純培養(yǎng)的標準菌株（ATCC23715）和各對照菌株按照細菌基因組快速抽提試劑盒操作說明書提取細菌基因組DNA。

1.1.5? 臨床糞便樣品DNA。

208份放牧牦牛、藏羊臨床糞便樣品分別采自青海省河南縣、共和縣、格爾木市、雜多縣、久治縣與及西藏那曲地區(qū)和日喀則市等地區(qū)。取1 g左右收集的糞便，置于5 mL滅菌PSB中，25 ℃下恒溫搖床增菌培養(yǎng)24 h。然后，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，收集沉淀，用于糞便基因組總DNA提取，糞便DNA提取按照糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）操作說明書進行操作。

1.2? 方法

1.2.1? LAMP檢測的建立及條件優(yōu)化。

按照Loopamp DNA擴增試劑盒推薦的體系建立耶氏菌LAMP檢測方法。反應體系（總體積為25 μL）如下：DNA模板2 μL，2 × 反應緩沖液（RM）12.5 μL，5 pmol/μL 的F3、B3引物各1 μL，40 pmol/μL的FIP、BIP引物各1 μL，20 pmol/μL 的LAMP熒光檢測試劑（FD）1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，去離子水4.5 μL。反應程序如下：60 ℃反應60 min，80 ℃滅活5 min。

試劑盒推薦反應時間為30～60 min。為了保證充分地擴增，首先擴增60 min進行LAMP擴增。為了摸索擴增反應的最適溫度，以標準菌株（ATCC23715）DNA為模板，分別在60、61、62、63、64和65 ℃條件下，按照試劑盒推薦的體系使用實時濁度儀進行LAMP擴增，80 ℃滅活5 min后，將LAMP產物按1∶4稀釋后，取2 μL加上樣緩沖液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2? LAMP特異性。

利用建立的LAMP檢測方法，在最適溫度下，以提取的標準菌株（ATCC23715）及對照菌株的基因組DNA為模板，進行LAMP擴增，80 ℃滅活5 min。將LAMP產物按1∶4稀釋后取2 μL加上樣緩沖液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時，以ATCC23715為模板，利用LAMP外引物F3、B3進行普通PCR擴增，擴增產物切膠回收后送交生工生物工程（上海））股份有限公司進行測序。測得序列在NCBI網站上進行在線比對，以驗證引物的特異性。

1.2.3? LAMP敏感性。

將提取的標準菌株（ATCC23715）的DNA使用核酸蛋白濃度測定儀進行濃度測定，并進行連續(xù)10倍倍比稀釋，即 1×10-1～1×10-8稀釋，對原液和稀釋后的DNA按照建立的LAMP方法，在最適溫度下進行LMAP擴增，80 ℃滅活5 min。取2 μL LAMP產物加上樣緩沖液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4? LAMP臨床樣品的檢測。

利用建立的LAMP方法對臨床上采集并提取的208份糞便樣品的DNA進行檢測。

2? 結果與分析

2.1? LAMP反應最適溫度的確定

以提取的標準菌株（ATCC23715）DNA為模板，按照試劑盒推薦的25 μL反應體系配制LAMP反應液，并設置陰性對照反應。分別在60、61、62、63、64和65 ℃條件下進行LAMP擴增反應。將LAMP反應產物進行1∶4稀釋后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，陰性對照的LAMP反應產物沒有可見的DNA條帶，而加入DNA模板的6支PCR管中的LAMP反應產物均擴增出“階梯狀”的DNA條帶，且反應溫度為63 ℃的LAMP擴增產物條帶最亮，DNA濃度最大，表明在63 ℃時LAMP反應擴增效率最高，63 ℃是最適反應溫度（圖1）。

2.2? LAMP反應特異性檢測

利用建立的LAMP檢測方法，在最適溫度63 ℃下以提取的標準菌株（ATCC23715）和其他6種對照菌株的基因組DNA為模板進行LAMP擴增。電泳結果顯示，只有標準菌株（ATCC23715）擴增出明顯的“階梯狀”的DNA條帶，而其他6株對照菌株和陰性對照均無可見DNA條帶，表明建立的LAMP方法具有良好的特異性（圖2）。同時，因為反應體系中加入了1 μL的FD，在紫外線下可見陽性樣品呈現綠色熒光，而陰性對照沒有熒光（圖3）。用LAMP外引物對標準菌株ATCC23715的DNA進行普通PCR擴增，電泳結果顯示獲得約240 bp大小的DNA條帶（圖4），與預期大小一致。PCR產物測序后返回的序列與目的基因進行Blast比對，同源性達100%，因此LAMP和PCR擴增的條帶均為目的基因。

2.4? LAMP反應臨床樣品的檢測

利用建立的LAMP檢測方法，對來自臨床采集的208份放牧牦牛、藏羊糞便樣品提取的DNA進行檢測，結果共檢測出陽性樣品26份，陽性率為12.5%（26/208）。

3? 討論與結論

耶氏菌是一種能引起人和動物嚴重的腸道疾病，主要癥狀有腹瀉、胃腸炎、腸系膜淋巴結炎，嚴重的可引起敗血癥，在世界范圍內造成了嚴重的經濟損失[10]。目前，針對耶氏菌的檢測，已經建立了很多方法，主要有免疫學檢測和病原培養(yǎng)鑒定等[11-14]。此外，也有將病原培養(yǎng)、免疫和PCR檢測相結合，檢測食品中耶氏菌的報道[15]。然而，人們普遍認為PCR和Real-time PCR是鑒定耶氏菌的最有效、靈敏、且特異的檢測方法[16-17]。

該研究通過對該細菌outL基因的保守序列，在線設計和篩選了一套LAMP引物，并建立了一種用于檢測耶氏菌的敏感性、特異性和適用性強的LAMP檢測方法。該方法通過LAMP技術檢測樣本中的DNA，與普通PCR技術相比LAMP方法對儀器和試驗條件的要求更低，不需要專門的PCR儀。同時，LAMP方法的擴增效率更高，在1 h內即可做出定性判斷。結果判斷方法很多，除了可以進行瓊脂糖凝膠電泳判定外，也可以根據濁度進行肉眼判斷，或者在反應液中加入熒光試劑，在紫外光下判定。后2種方法均不需要對擴增后的反應液進行開蓋，避免了DNA對試驗環(huán)境的污染。與傳統的細菌分離、培養(yǎng)鑒定方法相比，LAMP方法操作步驟簡便，對操作人員的要求更低，也降低了對環(huán)境的污染和操作人員感染的風險。這極大地縮短了檢測的總體時間，傳統的細菌培養(yǎng)、鑒定至少需要5～6 d，而該方法在30 h內即可做出結果判定，且可以對大量的臨床樣本進行批量操作。

因此，在該病的檢測、預防和控制過程中，建立的該LAMP方法為該病大量樣本的流行病學調查及其風險分析提供了一個行之有效的檢測工具，應在臨床上大量推廣使用。

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