NaCl脅迫對(duì)大豆生理特征的影響

于磊　劉宗林　徐宗藝　屈申　楊少彤

摘要? [目的]對(duì)大豆在不同濃度的NaCl鹽脅迫下的生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析。[方法]以大豆幼苗為研究材料，設(shè)置NaCl濃度梯度，對(duì)大豆幼苗施加NaCl鹽脅迫，測(cè)定其丙二醛含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、電導(dǎo)率等生理指標(biāo)。[結(jié)果]在鹽濃度遞增的情況下，丙二醛含量呈遞增趨勢(shì);SOD先增后減，在鹽濃度125 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值;POD先平緩后遞增;游離脯氨酸含量整體呈遞增趨勢(shì);葉綠素含量整體呈遞增趨勢(shì)，增長(zhǎng)較緩慢，最終趨于穩(wěn)定;電導(dǎo)率變化沒有規(guī)律可循，在125 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值。[結(jié)論]NaCl鹽脅迫會(huì)影響大豆的生理指標(biāo)，說明大豆植株的生理狀況隨生長(zhǎng)環(huán)境的改變而改變，大豆植株對(duì)不斷變化的環(huán)境具有一定的適應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞? 大豆;鹽脅迫;丙二醛;POD;葉綠素

中圖分類號(hào)? Q945??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào)? 0517-6611（2019）24-0039-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.013

Physiological Characteristics of Soybean under NaCl Stress

YU Lei1，2，LIU Zong-lin1，XU Zong-yi1 et al? （1.School of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040;2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract? [Objective]The physiological indexes of soybean under different NaCl stress were measured and analyzed.[Method]With soybean seedlings as research materials，NaCl concentration gradient was designed.After applying NaCl salt stress to soybean seedlings，the physiological indexes such as malondialdehyde content，SOD，POD，free proline content，chlorophyll content and electrical conductivity were measured.[Result]Through the determination of physiological indexes of soybean seedlings，the content of malondialdehyde increased in the case of increasing salt concentration;the SOD value increased first and then decreased，and reached the peak value when the salt concentration was 125 mmol/L;the POD value increased first and then increased;the content of proline showed an increasing trend;the overall chlorophyll content showed an increasing trend，the growth was slow firstly and finally stabilized;the conductivity change did not follow the law，reaching a peak at 125 mmol/L.[Conclusion]NaCl salt stress can affect the physiological indexes of soybean，indicating that the physiological condition of soybean plants varies with the change of growth environment，and soybean plants have certain adaptability to environmental change.

Key words? Glycine max（Linn.） Merr;Salt stress;Malondialdehyde;POD;Chlorophyll

基金項(xiàng)目? 大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練課題（201810225127）。

作者簡(jiǎn)介

于磊（1992—），男，山東萊陽人，博士研究生，研究方向：林木遺傳育種;劉宗林（1998—），男，山東煙臺(tái)人，從事植物生理研究;劉宗林和于磊為共同第一作者。

收稿日期? 2019-06-14;修回日期? 2019-06-25

大豆通稱黃豆，是雙子葉植物綱、豆科、大豆屬的一年生草本植物，其莖直立、粗壯，密被褐色長(zhǎng)硬毛。大豆中國重要糧食作物之一，是1種種子含有豐富植物蛋白質(zhì)的作物。大豆可以用來榨取豆油，制作各種豆制品以及釀造醬油。

鹽脅迫對(duì)植物的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育以及基因表達(dá)都會(huì)造成不同程度的影響，會(huì)影響植物的生理狀態(tài)。滲透調(diào)節(jié)能耗、碳同化量減少和維持生長(zhǎng)能耗增加等原因，多數(shù)植物在鹽脅迫下生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到顯著抑制[1];葉綠素酶活性提高導(dǎo)致葉綠素的降解，因此許多植物在鹽脅迫下光合色素含量降低[2]，但是低濃度的鹽脅迫可以促進(jìn)植物體內(nèi)光合色素含量的增加[5-6];在鹽脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，打破了正常情況下自由基產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡，使膜脂雙分子層過氧化，產(chǎn)生大量的丙二醛，并造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和電解質(zhì)大量滲漏，使植物生理失調(diào)[3-4];鹽分能增加細(xì)胞膜透性，使脂質(zhì)過氧化作用變強(qiáng)，最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)的破壞[7];當(dāng)遭受鹽脅迫時(shí)，植物常常通過抗氧化系統(tǒng)中的酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)之間的協(xié)同作用來抵御鹽脅迫引起的氧化脅迫[9];鹽脅迫下，細(xì)胞可以通過積累一些物質(zhì)，如脯氨酸、多胺、可溶性糖等來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)，維持水分平衡，還可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)許多重要代謝活動(dòng)所需的酶類活性[8];植物在逆境中為了抵抗傷害，常常通過鹽脅迫應(yīng)答基因的作用產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸，以保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，增加蛋白質(zhì)的可溶性，保持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以維持細(xì)胞正常的滲透勢(shì)[10]。

該研究對(duì)大豆幼苗進(jìn)行不同濃度梯度的NaCl溶液脅迫進(jìn)行處理，進(jìn)而對(duì)不同處理大豆幼苗的丙二醛含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、電導(dǎo)率等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和比較分析，研究不同濃度NaCl脅迫對(duì)大豆植株生長(zhǎng)和一些生理指標(biāo)的影響，旨在探究大豆的耐鹽性，并初步闡明其適應(yīng)鹽脅迫的生理機(jī)制，為今后在鹽堿地的推廣種植和促進(jìn)大豆的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料? 以大豆種子自然萌發(fā)而得的長(zhǎng)出三出復(fù)葉的大豆幼苗為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)所用藥品有不同濃度的NaCl鹽溶液;10%三氧乙酸（TCA）、0.6%硫代巴比妥酸（TBA）;3%堿基水楊酸、2.5%酸性茚三酮顯色液、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;80% 丙酮;磷酸緩沖液;0.013 mol/L甲硫氨酸溶液、氮藍(lán)四唑、核黃素。

1.2? 試驗(yàn)方法

對(duì)大豆幼苗分別施加0、50、75、100、125、150 mmol/L的NaCl鹽溶液進(jìn)行脅迫處理，每組處理設(shè)置2個(gè)重復(fù)，鹽脅迫處理7 d后，取每組處理的三出復(fù)葉，進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.1? 丙二醛含量的測(cè)定。①取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.5 g左右材料，置于5 mL離心管內(nèi);②加入5 mL 10%的三氯乙酸，提取30 min后，10 000? r/min離心15 min;③取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%TBA，混勻，在100 ℃沸水浴中加熱15 min，冷卻后再測(cè)量;④分別測(cè)定600、532和450 nm處的吸光值，以2 mL TCA代替提取液為對(duì)照組。

1.2.2? 游離脯氨酸含量的測(cè)定。

①提?。杭羲槿~片0.2 g置于大試管中，加入5 mL 3%堿基水楊酸溶液，用保鮮膜封口，于沸水浴中浸提10 min;②取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸、2 mL水和4 mL顯色液，于沸水浴中加熱40 min，取出冷卻后向各管加入5 mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層樣品，在520 nm的波長(zhǎng)下，以甲苯為對(duì)照進(jìn)行比色;③記錄光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定液中脯氨酸濃度，依據(jù)公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量。

1.2.3? 葉綠素含量的測(cè)定。取新鮮葉片0.2 g，把葉片剪碎置研缽中，加入80% 丙酮研成勻漿，繼續(xù)研磨，至組織變白無綠色，離心并過濾，用80% 丙酮定容至25 mL，將葉綠素丙酮提取液分別在波長(zhǎng)645、663 nm下測(cè)定吸光度，以80% 丙酮為空白，共3次重復(fù)。

1.2.4? POD值的測(cè)定。

取2只比色杯，一只比色杯加入3 mL反應(yīng)混合液和1 mL磷酸緩沖液混勻作為校零對(duì)照，另一只比色杯加入3 mL反應(yīng)混合液和1 mL酶液，立即秒表計(jì)時(shí)。于分光光度計(jì)470 nm波長(zhǎng)下測(cè)量，每隔1 min讀數(shù)1次，以每分鐘OD值的變化來表示酶活性大小。

1.2.5? SOD值的測(cè)定。

①取植物材料0.5 g，用磷酸緩沖液迅速研磨成粉，置于7 mL離心管內(nèi);

②加入5 mL磷酸緩沖液，提取30 min后，在4 ℃下1 000 r/min離心15 min;

③取上清液0.1 mL置于試管中，加反應(yīng)液及0.3 mL核黃素，于30 ℃、4級(jí)光照培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)7～8 min;

④另取2支試管，加入0.1 mL緩沖液、3.8 mL反應(yīng)液、0.3 mL核黃素，一支試管置于黑暗處作為調(diào)零，另一支作為對(duì)照組，與試驗(yàn)組一起進(jìn)行照光處理。

1.2.6? 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定。取每組處理的葉片，盡量保證每組樣品的一致性，每組葉片都用打孔器打9個(gè)葉盤沒入20? mL ddH2O中，10 min后用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率，記為R1;將溶液置于沸水浴中加熱30? min，待其冷卻后測(cè)定其電導(dǎo)率，記為R2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? NaCl濃度對(duì)丙二醛含量的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的丙二醛含量逐漸增加，且在125 mmol/L NaCl脅迫后丙二醛含量的增加變得更加顯著（圖1），而丙二醛會(huì)造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，因此丙二醛含量越大，鹽脅迫對(duì)大豆植株的危害越大。

2.2? NaCl濃度對(duì)游離脯氨酸含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的游離脯氨酸含量整體呈遞增趨勢(shì)，且在100 mmol/L NaCl脅迫后游離脯氨酸含量的增加變得更加顯著（圖2），推測(cè)大豆植株通過大量合成脯氨酸，使細(xì)胞滲透勢(shì)降低，進(jìn)而增強(qiáng)植株抗鹽性，以適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

2.3? NaCl濃度對(duì)葉綠素含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的葉綠素含量整體呈遞增趨勢(shì)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)較緩慢（圖3），推測(cè)大豆植株通過適當(dāng)合成葉綠素來增強(qiáng)植株光合作用，提高合成植物生長(zhǎng)必須物質(zhì)的效率，幫助大豆適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

2.4? NaCl濃度對(duì)POD活性的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的POD酶活性呈先減后增的趨勢(shì)，在75 mmol/L NaCl脅迫值時(shí)達(dá)到最低值，其后酶活增長(zhǎng)十分明顯（圖4），推測(cè)大豆植株通過增強(qiáng)POD酶活性的方式清除過氧化物，幫助大豆適應(yīng)高鹽環(huán)境。

2.5? NaCl濃度對(duì)SOD活性的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的SOD酶活性呈先增后減的趨勢(shì)，在125 mmol/L NaCl脅迫值時(shí)達(dá)到峰值，其后酶活緩慢降低（圖5），推測(cè)大豆植株通過增強(qiáng)SOD酶活性的方式清除過氧化物幫助大豆抵御低鹽逆環(huán)境，但過高鹽濃度環(huán)境會(huì)降低SOD酶活性，阻礙過氧化物的清除，降低大豆耐鹽能力。

3? 結(jié)論與討論

植物對(duì)環(huán)境作出的反應(yīng)既受基因的控制，又受個(gè)體所處的生存條件和生理生長(zhǎng)狀況的制約[11]，由于碳同化量減少、滲透調(diào)節(jié)能耗和維持生長(zhǎng)能耗增加等原因，多數(shù)植物在鹽脅迫下生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到顯著抑制[1]。該研究結(jié)果顯示，大豆植株中各生理指標(biāo)都有明顯變化，推測(cè)大豆植株可通過改變生理狀況來適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

葉片光合色素含量直接反映了植物的光合能力[12]。該研究結(jié)果顯示，大豆植株葉綠素含量緩慢增長(zhǎng)，未呈下降趨勢(shì)，推測(cè)大豆植株可能通過合成葉綠素增強(qiáng)光合作用，以此抵御鹽脅迫環(huán)境。但整體未呈下降趨勢(shì)，也可能是因?yàn)樘幚頋舛炔粔颍诤罄m(xù)的試驗(yàn)中可以增大NaCl濃度，驗(yàn)證大豆植株在高鹽環(huán)境中的葉綠素含量變化。

植物在鹽脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，打破了正常情況下維持的自由基產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡，使膜脂雙分子層過氧化，產(chǎn)生大量的丙二醛，并造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，電解質(zhì)大量滲漏，使植物生理失調(diào)[3-4];SOD和POD能夠分別清除O2-和H2O2[13-15]。該研究結(jié)果顯示，NaCl脅迫處理后大豆葉片MDA含量顯著提高，并且隨著鹽濃度的升高，MDA含量增長(zhǎng)幅度越大;同時(shí)，POD和SOD酶活性明顯提高。推測(cè)鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，造成了大豆的膜脂過氧化傷害，同時(shí)誘導(dǎo)體內(nèi)酶的抗氧化物質(zhì)發(fā)揮作用，以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力而清除體內(nèi)的自由基，降低膜脂過氧化的程度，這與徐寧等[16]的研究結(jié)果一致。

植物在遭受鹽脅迫后，其細(xì)胞膜透性會(huì)增加，胞內(nèi)電解質(zhì)隨之外滲，因此導(dǎo)致植物細(xì)胞浸提液電導(dǎo)率增大[17]。在后續(xù)的試驗(yàn)中會(huì)分析與完善鹽脅迫下大豆植株電導(dǎo)率數(shù)據(jù)，以便進(jìn)一步豐富大豆抵御鹽脅迫的生理指標(biāo)數(shù)據(jù)。

有研究認(rèn)為，鹽脅迫下游離脯氨酸含量變化與植物抗鹽性存在正相關(guān)關(guān)系[18-19]，該研究大豆植株中游離脯氨酸含量隨鹽濃度的增加而增加。推測(cè)在鹽脅迫處理下，游離脯氨酸成為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持滲透平衡，以減緩鹽分對(duì)大豆植株的侵害。

該研究通過對(duì)NaCl脅迫處理下的大豆植株進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，歸納大豆植株在鹽脅迫處理下的生理狀況，推測(cè)大豆植株可以在低鹽環(huán)境中進(jìn)行栽植。為了進(jìn)一步研究大豆的抗鹽能力，可以采用復(fù)合鹽進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)。該研究為大豆在自然鹽環(huán)境中的大量種植提供數(shù)據(jù)參考，為培育新型良種轉(zhuǎn)基因大豆提供參考依據(jù)，并豐富了逆境生物學(xué)理論。

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