免疫性血小板減少癥氣不攝血證小鼠模型血管內(nèi)皮活性物質(zhì)變化動(dòng)態(tài)研究

武曲星 王攀 王冬芝 藺亞?wèn)| 張伏芝 劉建勛 任鈞國(guó)

摘要：目的 ?從血管內(nèi)皮活性物質(zhì)角度探討免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）氣不攝血證血管損傷情況及出血機(jī)制的動(dòng)態(tài)變化。方法??采用睡眠剝奪復(fù)合免疫法制備ITP氣不攝血證小鼠模型，第1周進(jìn)行睡眠剝奪，第2、3周睡眠剝奪同時(shí)注射抗血小板血清（APS）進(jìn)行免疫。將Balb/C小鼠分為正常組和模型組，各組再分為7、10、21 d 時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)正常組10只、模型組12只，觀察各時(shí)間點(diǎn)小鼠體征，檢測(cè)小鼠體質(zhì)量及血小板、抓力、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，ELISA檢測(cè)血清血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）含量，AimPlex流式高通量多因子法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（sICAM-1）、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1（sVCAM-1）含量。結(jié)果??與正常組比較，模型組第7日小鼠精神狀態(tài)萎靡，倦怠蜷縮，極少活動(dòng)，此狀態(tài)隨時(shí)間延長(zhǎng)日益加重，體質(zhì)量、抓力、血小板、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01），vWF、NO、ET-1顯著升高（P<0.01）;注射APS后，模型組小鼠腹部、腿部有出血點(diǎn)，便血情況發(fā)生，第2次注射后出血最為嚴(yán)重，此后逐日減輕，小鼠體質(zhì)量、抓力、血小板、胸腺指數(shù)、VEGF-A、sVCAM-1顯著降低（P<0.01，P<0.05），脾臟指數(shù)、vWF、NO、ET-1顯著升高（P<0.01）;第21日模型組小鼠出血較輕，體質(zhì)量、抓力、血小板、胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01），脾臟指數(shù)、vWF、NO、ET-1、sICAM-1顯著升高（P<0.01）。結(jié)論??ITP氣不攝血證小鼠模型存在血管損傷：造模第7日以血管內(nèi)皮凝血功能紊亂為主，第10日以血管內(nèi)皮通透性改變?yōu)橹?，?1日以血管內(nèi)皮免疫功能紊亂為主。

關(guān)鍵詞：免疫性血小板減少癥;氣不攝血證;血管活性物質(zhì);病證結(jié)合模型

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）12-0056-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.013 ??開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Dynamic Study on Changes of Vascular Endothelial Active Substances in Mice Model of Immune Thrombocytopenia with Syndrome of Qi Failing to Control Blood

WU Quxing^1，2，?WANG Pan²， WANG Dongzhi²， LIN Yadong²， ZHANG Fuzhi^1，2，?LIU Jianxun²， REN Junguo²

1. Graduated School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing?100029， China; 2. Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

Abstract：?Objective?To explore the dynamic changes of vascular injury and bleeding mechanism of immune thrombocytopenia?（ITP） with syndrome of qi failing to control blood from the perspective of vascular?endothelial active substances. Methods?ITP with syndrome of qi failing to control blood model was built by sleep deprivation combined with immunoassay. Mice were subjected to sleep deprivation at week 1 and sleep deprivation with immunization with anti-platelet serum （APS） at week 2 and 3. Mice were divided into normal group and model group， and divided into three time points： 3?d， 10 d， 21 d. There were 10 mice in the normal group and 12 mice in the model group?at each time point. Body signs of each time point were observed and body weight， platelet， grip， spleen index， and thymus index were recorded. vWF， NO and ET-1 were measured by ELISA. VEGF-A， sICAM-1， sVCAM-1 were?measured by AimPlex flow high-throughput multifactor. Results?Compared with the normal group， after 7 days of sleep deprivation， mice in the model group were mentally depressed， tired and curled up with little activity. This state increased with the deprivation time. The body weight， grip， platelet， spleen index and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. After the injection of APS， the bleeding point appeared in the abdomen and legs of the mice and hematochezia occurred in mice. After the second injection， the bleeding was the most serious， and then decreased day by day， the mouse weight， the grip， the platelets， thymus index， VEGF-A and sVCAM-1 significantly decreased （P<0.01， P<0.05）， and the spleen index， vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. There was less bleeding?on the 21st day. The body weight， grip， platelet and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and the spleen index， vWF， NO， ET-1 and sICAM-1 significantly increased （P<0.01）. Conclusion?Vascular injury is found in the model of ITP with syndrome of qi failing to control blood. On the 7th day， vascular endothelial coagulation dysfunction is dominant， on the 10th day， change of vascular endothelial permeability is dominant， and on the 21st day， vascular endothelial immune dysfunction is dominant.

2.2 ?造模

在前期研究基礎(chǔ)上，采用睡眠剝奪復(fù)合免疫方法^[8-10]進(jìn)行造模。睡眠剝奪：將小鼠置于自制水平臺(tái)（水平臺(tái)規(guī)格：平臺(tái)高40 mm、底盤(pán)直徑60 mm、中間豎管直徑10 mm、頂盤(pán)直徑25 mm）上，每籠4個(gè)水平臺(tái)，放置3只小鼠。使用鐵絲網(wǎng)將睡眠剝奪籠蓋住并固定，保證小鼠無(wú)法逃脫，但可以移動(dòng)。食物與飲用水瓶置于鐵絲網(wǎng)食槽內(nèi)，使小鼠可自由攝食飲水，若小鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)，會(huì)因肌肉松弛而落入水中，從而使小鼠始終保持清醒狀態(tài)。采取隨機(jī)時(shí)間段剝奪方法，平均每日剝奪19 h。每日剝奪結(jié)束后，將小鼠取出，放回鼠籠。免疫：按100 μL/20 g腹腔注射APS，隔日1次，共注射7次。造模：第1周進(jìn)行睡眠剝奪，第2、3周睡眠剝奪復(fù)合注射APS免疫。

2.3 ?分組

將雄性Balb/C小鼠分為正常組和模型組，各組再分為7、10、21 d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，正常組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只，模型組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各12只。模型組睡眠剝奪7 d后，在睡眠剝奪同時(shí)，每隔1 d注射APS;正常組每隔1 d注射生理鹽水。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，常規(guī)制備血清，-80 ℃冰箱貯藏備用，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 ?檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 ?小鼠體征

觀察小鼠精神狀態(tài)、毛色、大便、出血情況等。

2.4.2 ?體質(zhì)量

測(cè)量小鼠體質(zhì)量。

2.4.3 ?抓力

使用大小鼠抓力測(cè)定儀測(cè)定小鼠抓力。

2.4.4 ?血小板計(jì)數(shù)

取小鼠尾靜脈血，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)量血小板數(shù)量。

2.4.5 ?臟器指數(shù)

小鼠麻醉，取脾臟、胸腺，生理鹽水沖洗后稱重。計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（%）=臟器濕重（g）÷小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

2.4.6 ?ELISA檢測(cè)血清血管性血友病因子、一氧化氮和內(nèi)皮素-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清vWF、NO、ET-1含量。

2.4.7 ?流式法檢測(cè)血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按AimPlex流式高通量多因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量。

3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?體征變化

正常組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，活動(dòng)性良好，毛色純白有光澤，大便呈黃褐色，條狀，顆粒清晰。第7日模型組小鼠精神狀態(tài)萎靡，反應(yīng)遲鈍，每日停止睡眠剝奪后，倦怠蜷縮，極少活動(dòng)，毛色黯黃粗糙，大便呈黑褐色或黃色，便稀，隨時(shí)間延長(zhǎng)日益加重。第10日（注射APS后3 d），小鼠腹部、腿部出現(xiàn)出血點(diǎn)（見(jiàn)圖1），便血情況出現(xiàn)，第2次注射后，小鼠出血最為嚴(yán)重，此后逐日減輕，第21日已無(wú)出血情況。

4.2 ?體質(zhì)量變化

與正常組比較，模型組小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量均顯著降低（P<0.01），見(jiàn)表1。

4.3 ?抓力變化

與正常組比較，模型組小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)抓力均顯著降低（P<0.01），見(jiàn)表2。

4.4 ?血小板計(jì)數(shù)變化

與正常組比較，模型組小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)均顯著降低（P<0.01），其中第10日模型組血小板計(jì)數(shù)最低，見(jiàn)表3。

4.5 ?脾臟指數(shù)變化

與正常組比較，模型組小鼠第7日脾臟指數(shù)顯著降低（P<0.01），第10、21日脾臟指數(shù)顯著增加（P<0.01），隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組脾臟指數(shù)逐漸升高，見(jiàn)表4。

4.6 ?胸腺指數(shù)變化

與正常組比較，模型組小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01，P<0.05），見(jiàn)表5。

4.7 ?血清血管性血友病因子、一氧化氮和內(nèi)皮素-1變化

與正常組比較，模型組小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)vWF、NO、ET-1均顯著升高（P<0.01），見(jiàn)表6～表8。

4.8 ?血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1和可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1變化

與正常組比較，模型組小鼠第7日VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第10日VEGF-A、sVCAM-1含量顯著降低（P<0.01），第21日sICAM-1含量顯著升高（P<0.01），VEGF-A、sVCAM-1含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表9～表11。

5 ?討論

氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的精微物質(zhì)，血為脈管中流動(dòng)的紅色液體，二者相互作用，保證人體機(jī)能的正常運(yùn)行。在中醫(yī)理論中，血證有廣義與狹義之分，其中廣義的血證是指與血液有關(guān)的疾病，狹義的血證是指由于各種原因?qū)е碌难谎?jīng)，溢出脈外。氣不攝血是血證的常見(jiàn)病機(jī)，其辨證要點(diǎn)為出血和氣虛。由于氣的統(tǒng)攝作用，血液才可循行脈中，若氣虛無(wú)法統(tǒng)攝，血溢脈外，則會(huì)出現(xiàn)各類(lèi)出血。

ITP為臨床常見(jiàn)的出血性疾病，由于自身免疫系統(tǒng)識(shí)別血小板表面糖蛋白并進(jìn)行清除或影響血小板生成，造成血小板數(shù)量暫時(shí)或持續(xù)減少。氣不攝血證是ITP主要的證型之一。目前，ITP動(dòng)物模型造模方法較多，如注射APS^[9]、抗原模擬法^[11]等，但尚無(wú)對(duì)ITP氣不攝血證小鼠模型的研究，通過(guò)對(duì)CBA/J小鼠腹腔注射哺乳后雌性Wistar大鼠提純后血小板，采用睡眠剝奪復(fù)合免疫方法進(jìn)行造模，出現(xiàn)氣虛與血小板計(jì)數(shù)下降癥狀，但并未出現(xiàn)出血癥狀^[10]。僅注射APS便可出現(xiàn)較為明顯的出血癥狀，說(shuō)明此方法可能對(duì)血管造成較大影響，為更好研究ITP氣不攝血證小鼠血管內(nèi)皮的變化，本實(shí)驗(yàn)采用水平臺(tái)睡眠剝奪法復(fù)合注射APS進(jìn)行造模。

本實(shí)驗(yàn)以小鼠體征、體質(zhì)量及抓力作為判斷小鼠氣虛指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，睡眠剝奪第7日，模型組小鼠已出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡不振、反應(yīng)遲鈍、倦怠蜷縮等癥狀，體質(zhì)量、抓力明顯下降，表明睡眠剝奪7 d已出現(xiàn)氣虛癥狀，隨時(shí)間延長(zhǎng)，氣虛癥狀加重。注射APS后，模型組小鼠血小板迅速下降，出現(xiàn)較為明顯的出血點(diǎn)，并且有便血情況發(fā)生，表明存在消化道出血。此后隔日注射APS，出血情況日益減輕。

脾臟與胸腺是重要的免疫器官，脾臟也是血小板消除的主要器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，睡眠剝奪第7日，小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低，表明睡眠剝奪可明顯降低免疫功能;注射APS后3 d（第10日），小鼠脾臟指數(shù)顯著升高，并隨著剝奪和注射時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠脾臟指數(shù)逐漸升高，而胸腺指數(shù)則仍然顯著降低，提示脾臟指數(shù)的升高主要是由血小板消除導(dǎo)致的，機(jī)體的免疫功能仍然處于低下?tīng)顟B(tài)。

在睡眠剝奪7 d后，模型組小鼠血小板明顯降低，表明僅進(jìn)行睡眠剝奪造成小鼠氣虛狀態(tài)，也會(huì)出現(xiàn)血小板降低的情況。注射APS后，模型組小鼠血小板迅速下降。此后隔日注射APS，血小板出現(xiàn)緩慢回升，通過(guò)注射APS可維持較低的血小板計(jì)數(shù)。

vWF是一種大分子糖蛋白多聚體，多由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，少部分由巨核細(xì)胞產(chǎn)生^[12]，其作用主要是誘導(dǎo)血小板的黏附與聚集，作用于血管內(nèi)皮損傷部位，促進(jìn)凝血;穩(wěn)定凝血因子Ⅷ，作為載體形成復(fù)合物^[13-14]。vWF濃度可在一定程度上作為血管內(nèi)皮損傷程度的標(biāo)志物^[15]。與正常組比較，模型組血清vWF含量顯著升高，表明僅進(jìn)行睡眠剝奪，血管內(nèi)皮已有一定程度的損傷，注射APS和持續(xù)睡眠剝奪維持了持續(xù)性的損傷。

NO和ET-1是人體內(nèi)廣泛存在的一對(duì)信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)血管、傳遞神經(jīng)信號(hào)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等方面均起到重要的作用。與健康對(duì)照組比較，臨床ITP患者的NO/一氧化氮合酶（NOS）與活性氧均顯著升高，且二者呈正相關(guān)^[16]，推測(cè)NO/NOS可能是通過(guò)參與ROS產(chǎn)生，并增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性^[17-18]。睡眠剝奪7日后，二者顯著升高，說(shuō)明小鼠內(nèi)皮遭到損傷。注射APS和持續(xù)睡眠剝奪維持了較高的NO和ET-1水平。

VEGF是人體內(nèi)作用最強(qiáng)的增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性因子^[19]，VEGF家族有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C等多種亞型。在不同的出血性疾病中，VEGF表達(dá)各不相同^[20]。本實(shí)驗(yàn)第10日模型組VEGF-A水平顯著降低，是由于開(kāi)始注射APS，產(chǎn)生的刺激較強(qiáng)，內(nèi)皮損傷較單純睡眠剝奪更嚴(yán)重，VEGF-A迅速下降。

ICAM-1與VCAM-1均為黏附分子，二者均屬免疫球蛋白超家族。ICAM-1的作用為促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞在血管內(nèi)皮進(jìn)行黏附，是淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的核心分子^[21]。正常情況下，ICAM-1幾乎不在內(nèi)皮細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)。當(dāng)有免疫反應(yīng)發(fā)生時(shí)，分泌增多。VCAM-1與ICAM-1作用類(lèi)似，可促進(jìn)白細(xì)胞向血管內(nèi)皮黏附。模型組第10日sVCAM-1顯著降低，第21日sICAM-1血清濃度顯著升高。表明第10日主要是血管內(nèi)皮出現(xiàn)異常，但并未出現(xiàn)sVCAM-1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，后期出現(xiàn)sICAM-1介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞黏附，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞通透性，使淋巴細(xì)胞更容易穿透血管內(nèi)皮。

綜上，ITP氣不攝血證小鼠血管內(nèi)皮受到一定程度損傷。在整個(gè)造模過(guò)程中小鼠vWF、NO、ET-1均升高，說(shuō)明NO、ET-1異常貫穿整個(gè)造模過(guò)程;第10日（注射APS后3 d）VEGF-A和sVCAM-1水平顯著降低，此時(shí)間點(diǎn)出血最為嚴(yán)重，說(shuō)明血小板下降迅速，導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損，VEGF-A與sVCAM-1的降低與出血有關(guān);第21日sICAM-1顯著升高，說(shuō)明造模后期小鼠機(jī)體反應(yīng)以免疫反應(yīng)為主，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷主要是由sICAM-1誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞黏附造成。

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（收稿日期：2019-04-16）

（修回日期：2019-06-13;編輯：華強(qiáng)）