高效液相色譜法聯(lián)用蒸發(fā)光散射測(cè)定薏苡仁多糖的單糖組成

茅宇娟，王 歡，曾 陵，陳 虹

(1.張家港市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，江蘇 張家港 215600；2.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009；3.蘇州富士萊醫(yī)藥股份有限公司,江蘇 蘇州 215522)

薏苡仁，俗稱米仁、六谷子，又名薏仁、薏米、苡仁等，為禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL. var. mayuen (Roman) Stapf的干燥成熟種仁，具有健脾、除痹、滲濕和止瀉等功效，臨床上主要用于治療水腫、濕痹拘攣、小便不利、腳氣以及脾虛瀉泄等病癥[1-2]。薏苡仁主要分布于福建、河北和遼寧等地，在我國(guó)長(zhǎng)江以南(貴州、廣西、福建和臺(tái)灣)、泰國(guó)、越南和老撾等地均有種植[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：薏苡仁的主要活性成分包括大分子如多糖類，小分子如內(nèi)酰胺類、不飽和脂肪酸類及酯類等，具有降血糖、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛以及提高機(jī)體免疫力等藥理活性[5-6]。薏苡仁中含多糖類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)65%～70%，其中淀粉占60%～65%，其他多糖占5%[7]。劉想[8]采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)純化后的薏苡仁多糖進(jìn)行了組成分析，證明薏苡仁多糖包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

目前，測(cè)定多糖中單糖組成的定量方法還有很多，例如早期常用的薄層色譜法[9]、紫外分光光度法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[10]等，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)在的檢測(cè)方法也越來越多，例如高效液相色譜-示差檢測(cè)法[11]、高效液相體積排阻色譜法[12]、離子色譜法[13]和高效毛細(xì)管電泳法[14]等。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC聯(lián)合通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)對(duì)薏苡仁多糖的單糖組成進(jìn)行測(cè)定，該方法與其他幾種方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)對(duì)于分析單糖組成復(fù)雜的多糖，該方法分離度好，靈敏度高，對(duì)于常見的單糖成分均能達(dá)到有效分離；2)供試品溶液的制備方法簡(jiǎn)單，無須進(jìn)行柱前衍生化，即可直接進(jìn)行測(cè)定；3)色譜條件成本較低，其中色譜柱是氨基柱，相對(duì)于其他方法的毛細(xì)管柱、糖柱更經(jīng)濟(jì)；4)該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、操作快捷，是一種值得大力推廣的單糖組成分析方法。

目前對(duì)薏苡仁多糖的研究主要還是集中在藥理實(shí)驗(yàn)上，而對(duì)其結(jié)構(gòu)組成卻缺乏數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法對(duì)薏苡仁多糖的單糖組成進(jìn)行測(cè)定，旨在為闡明薏苡仁多糖的結(jié)構(gòu)組成奠定基礎(chǔ)，以期為構(gòu)效關(guān)系及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的分析提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

三氟乙酸(HPLC)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈(HPLC)，美國(guó)Merck公司；其他試劑均為分析純。D-甘露糖(批號(hào)：LG20M03)、L-阿拉伯糖(批號(hào)：LMA0L06)和巖藻糖(批號(hào)：L630014),北京百靈威科技有限公司;L-鼠李糖(批號(hào)：10158772),阿法莎(天津)化學(xué)有限公司;D-葡萄糖醛酸(批號(hào)：140648-200602),中國(guó)藥品生物制品檢定所;D-半乳糖醛酸(批號(hào)：A0404A),大連美侖生物技術(shù)有限公司;D-葡萄糖(批號(hào)：K7TFO-CN),東京化成工業(yè)株式會(huì)社;D-半乳糖(批號(hào)：10509),德國(guó)Augsburg公司;薏苡仁多糖(批號(hào)：20161212、20161214和20161218),自制。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀、ELSD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布奇公司；CPA224D型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；純水儀，美國(guó)密理博公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Supelco?APHERA NH2Polymer色譜柱(150 mm×2 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液(體積比為85∶ 15)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃；ELSD檢測(cè)條件：蒸發(fā)溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)對(duì)照品50 mg，置同一50 mL量瓶中，加適量水使其溶解，并定容至刻度、搖勻，即得混合單糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3 薏苡仁多糖的制備

稱取薏苡仁適量，搗碎，加10倍量95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾，藥渣晾干至無醇味，加10倍量的水水浴提取2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮，加入95%乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4 ℃下靜置4 h，離心，沉淀減壓干燥，即得薏苡仁多糖。

1.3.4 供試品溶液的制備

精密稱取薏苡仁多糖干燥品10 mg，置安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸5 mL，密封，于110 ℃下水解8 h，冷卻至室溫，準(zhǔn)確移取1 mL水解液，80 ℃ N2吹干，加60%(體積分?jǐn)?shù))乙腈轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在1.3.1項(xiàng)色譜條件下，Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara、Fuc 8種單糖分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以8種單糖計(jì)均不低于4 000，如圖1所示。由圖1可知，該色譜系統(tǒng)適用性良好，可以用來準(zhǔn)確測(cè)定薏苡仁多糖中的單糖組成。

圖1 對(duì)照品溶液(a)、供試品溶液(b)的 HPLC-ELSD色譜Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram of reference solution (a) and test solution (b)

在進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)過程中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。氨基柱分析多糖類成分所用流動(dòng)相通常為乙腈和水按一定比例組成的混合溶液。實(shí)驗(yàn)初期使用的流動(dòng)相就是不同比例的乙腈-水混合溶液，但均不能達(dá)到良好的分離度，可能由于涉及的單糖種類太多，且極性過于相近，于是往水中加入緩沖鹽醋酸銨，配制成濃度為0.05 mol/L的溶液，結(jié)果8種單糖均得到良好分離，故最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液，體積比85∶ 15。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)ELSD的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通常影響測(cè)定結(jié)果的最主要參數(shù)就是蒸發(fā)溫度和載氣流量，其對(duì)信噪比影響很大。本實(shí)驗(yàn)考察蒸發(fā)溫度的點(diǎn)分別為50、60、70和80 ℃，載氣流量分別為1.2、1.6和2.0 L/min，結(jié)合信噪比結(jié)果見圖2。由圖2可知：蒸發(fā)溫度在50 ℃時(shí)信噪比最低，60 ℃最高，70和80 ℃居中；而載氣流量對(duì)信噪比的影響則是1.6 L/min最大，故最終選擇蒸發(fā)溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min，此條件下系統(tǒng)靈敏度最高。

圖2 蒸發(fā)溫度(a)和載氣流量(b)對(duì)信噪比的影響Fig.2 Effects of evaporation temperature (a) and carrier gas flow rate (b) on signal-to-noise ratio

2.2 線性關(guān)系考察

分別精密量取1.3.2項(xiàng)下的儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品系列溶液。按1.3.1節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，單糖峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示各成分線性關(guān)系良好，回歸方程見表1。由表1可知：8種單糖的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在0.5～5μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，因此可以準(zhǔn)確測(cè)定8種單糖的含量。

表1 8種單糖線性關(guān)系

2.3 精密度試驗(yàn)

取1.3.2節(jié)中的方法配制所得的對(duì)照品溶液(濃度為0.2 mg/mL)，在1.3.1節(jié)中的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得8種單糖峰面積，計(jì)算得GlcA、Man、Fuc、Rha、GalA、Gal、Ara和Glc峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.15%、1.55%、1.25%、1.44%、1.58%、0.83%、1.37%和1.77%，RSD值均低于2%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份同一批次的樣品(批號(hào)：20161212)，按1.3.4節(jié)中的方法制備供試品溶液的方法進(jìn)行操作，依1.3.1節(jié)中的方法色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果表明：該多糖主要由7種單糖組成，分別為Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara，其含量RSD分別為1.26%，1.44%，1.65%，1.84%、0.77%，1.17%、0.94%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.4節(jié)中的方法制備的同一份供試品溶液，以1.3.1節(jié)的色譜條件，分別于0、2、4、8、12和24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明：Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara峰面積的RSD分別為1.34%、0.63%、1.78%、1.19%、0.85%、1.63%和1.54%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn)

稱取批號(hào)為20161212的薏苡仁多糖5 mg，共6份，分別精密加入一定量的Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara對(duì)照品溶液，使加入量與供試品中含量比約為1∶ 1，分別按1.3.4節(jié)中的供試品溶液制備方法操作，并在1.3.1節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。由表2可知：該方法回收率良好，回收率均在97.4%～100.4%。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 樣品測(cè)定

分別取3批薏苡仁多糖，分別按1.3.4節(jié)中的供試品溶液制備方法操作，并在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

由表3可知：薏苡仁多糖主要由Glc組成，另外還含有少量的Gal、Fuc、Rha、GlcA、Man和Ara。本研究制備所得薏苡仁多糖組成與劉想[8]報(bào)道的結(jié)果略有不同，本研究結(jié)果比其多了GlcA和Fuc，少了木糖(Xyl)，推測(cè)原因可能是由于制備純化工藝不同，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)組成略有差異。

表3 薏苡仁多糖中單糖組成測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

建立了一種適用于測(cè)定薏苡仁多糖中單糖組成的HPLC-ELSD方法，通過色譜條件優(yōu)化，最終確立最佳色譜條件：色譜柱為Supelco?APHERA NH2Polymer色譜柱 (150 mm×2 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液(體積比85∶ 15)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL； 柱溫為35 ℃；ELSD檢測(cè)條件為漂移管溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min。研究結(jié)果表明：Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara和Fuc的進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值與峰面積對(duì)數(shù)值在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系(0.991～0.999 9)，回收率均在97.4%～100.4%，RSD均小于2%。證明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，分離效果好，可用于測(cè)定薏苡仁多糖的單糖組成。