豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

宋楠 何愛(ài)娟

軟骨缺損臨床較為常見(jiàn)，因其自我修復(fù)能力低，多需進(jìn)行自體軟骨移植以重建關(guān)節(jié)功能[1-3]。組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)提供了嶄新的思路，有望解決目前關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)面臨的困難。

BMSC 具有軟骨形成能力強(qiáng)、來(lái)源廣泛、獲取損傷輕、無(wú)供區(qū)缺損、可重復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)，是關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的理想種子細(xì)胞。前期研究已證實(shí)，應(yīng)用BMSCs 復(fù)合聚羥基乙酸/多聚乳酸（PGA/PLA）可成功修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損[4-5]，但軟骨體內(nèi)再生的穩(wěn)定性不足，成功率較低。另有研究表明，大量PGA支架材料及其降解產(chǎn)物在體內(nèi)可引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而干擾軟骨的體內(nèi)再生。因此，將BMSCs 復(fù)合PGA/PLA 支架體外共培養(yǎng)，待支架材料大部分降解后再植入體內(nèi)，或可獲得更為理想的修復(fù)效果。然而，目前仍不清楚BMSCs 體外構(gòu)建軟骨植入體內(nèi)后是否能進(jìn)一步成熟并修復(fù)軟骨缺損。

為此，我們以豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，用自體BMSCs 體外構(gòu)建的軟骨移植修復(fù)缺損，評(píng)估BMSCs 體外構(gòu)建軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的可行性及其長(zhǎng)期功能轉(zhuǎn)歸，并同時(shí)檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 的表達(dá)，以初步闡述該方法是否可避免或延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

普通健康長(zhǎng)楓雜交豬（上海青浦養(yǎng)豬場(chǎng)），4～6 月齡，體質(zhì)量15～30 Kg 不等，雌雄不限（n=7）。后肢膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)外側(cè)髁制備直徑10 mm 的全厚軟骨缺損，以BMSCs 體外構(gòu)建軟骨進(jìn)行修復(fù)（實(shí)驗(yàn)組，n=7）；創(chuàng)面曠置作為空白對(duì)照組（n=3）；單純PGA/PLA 材料修復(fù)作為單純材料組（n=5）；正常關(guān)節(jié)作為正常對(duì)照組（n=13）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM 培養(yǎng)液、ITS（Gibco，美國(guó)）；L-谷氨酰胺、維生素C、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；青霉素、鏈霉素（上海新華制藥廠）；10%胎牛血清（HYCLONE，美國(guó)）；100 mm 培養(yǎng)皿、0.22 μm 目濾器、50 mL 離心管、6 孔培養(yǎng)板（Falcon，美國(guó)）；TGF-β1（每支20 μg，Intergen，美國(guó)）；IGF-1（每支50 μg，Intergen，美國(guó)）；地塞米松（2 mg/mL，Sigma，美國(guó)）；非編織聚羥基乙酸纖維（PGA，上海國(guó)睿生命科技有限公司）；單克隆抗體ab34712（Abcam，英國(guó)）。

1.3 BMSCs 分離培養(yǎng)及擴(kuò)增

每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽取10 mL 骨髓，全血培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs 原代細(xì)胞[6]。將接種好的培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)5 d 后首次換液，加入PBS 緩沖液反復(fù)漂洗，去除未貼壁血細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞接近70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集第2 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 PGA/PLA 支架材料的制備

取非編織聚羥基乙酸（PGA）15 mg，放入圓形注射器中，加入少許無(wú)水乙醇將其壓制成型，滴加1%（1 g 的PLA 溶于100 mL 的二氯甲烷）的PLA 塑形，制成直徑10 mm、厚度2 mm 的PGA/PLA 支架。將制備好的支架材料滅菌后預(yù)培養(yǎng)48 h，確定無(wú)污染后用于細(xì)胞接種。

1.5 細(xì)胞-材料復(fù)合物的制備

第2 代BMSCs 離心棄上清，新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為50×106cells/mL。以無(wú)菌滴管吸取細(xì)胞懸液均勻滴種在支架材料上（每塊材料接種約0.1 mL 細(xì)胞懸液），置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度下孵育4 h，加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，換軟骨誘導(dǎo)液（含0.3 g/L L-谷氨酰胺、0.05 g/L抗壞血酸、3.7 g/L 碳酸氫鈉、10 萬(wàn)U/L 青霉素鉀、0.1 g/L 硫酸鏈霉素，10 ng/mL TGF-β1、100 ng/mL IGF-I、1%ITS、40 ng/mL 地塞米松的高糖DMEM 培養(yǎng)液）進(jìn)行軟骨定向誘導(dǎo)。每隔2 d 全量換液，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞基質(zhì)分泌情況，以及與PGA 纖維的黏附情況。

1.6 構(gòu)建軟骨的大體觀察、組織學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)8 周時(shí)，每只動(dòng)物各取1 個(gè)樣本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)檢測(cè)。HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)；Safranin-O 染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)中GAG 的合成和分泌情況；免疫組化觀察細(xì)胞Ⅱ膠原蛋白的合成和分泌情況[6]。

1.7 缺損修復(fù)

實(shí)驗(yàn)組用體外誘導(dǎo)了8 周的組織工程軟骨植入缺損處，5-0 可吸收縫線縫合固定（圖1）；空白對(duì)照組創(chuàng)面曠置；材料對(duì)照組以PGA/PLA 材料修復(fù)缺損；以正常關(guān)節(jié)作為正常對(duì)照組。

圖1 關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)模型Fig.1 Repair model of articular cartilage defect

1.8 組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后6 個(gè)月取材行大體觀及組織學(xué)檢測(cè)。大體觀察修復(fù)區(qū)軟骨的大小、形態(tài)、色澤、表面情況、修復(fù)厚度及其相鄰正常關(guān)節(jié)軟骨的界面愈合情況，同時(shí)沿軟骨修復(fù)區(qū)中線鋸開(kāi)關(guān)節(jié)，觀察修復(fù)區(qū)軟骨與軟骨下骨的界面愈合情況。

HE 染色觀察修復(fù)區(qū)有無(wú)軟骨細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞排列情況、與周?chē)ｊP(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的界面愈合情況、修復(fù)區(qū)域的厚度及平整度、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積情況等。

1.9 關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子檢測(cè)

術(shù)前及術(shù)后6 個(gè)月時(shí)抽取豬關(guān)節(jié)液，檢測(cè)關(guān)節(jié)液的IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 因子的表達(dá)水平（n=3）[6]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 體外構(gòu)建軟骨大體觀及組織學(xué)檢測(cè)

體外軟骨構(gòu)建8 周后，實(shí)驗(yàn)組修復(fù)處形成了表面光滑、瓷白色的軟骨樣組織。HE 染色可見(jiàn)明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，陷窩周?chē)兴{(lán)染的細(xì)胞外基質(zhì)沉積；Safranin-O 染色及免疫組化顯示，軟骨陷窩周?chē)写罅康腉AG 及Ⅱ型膠原蛋白沉積。這些結(jié)果說(shuō)明體外誘導(dǎo)8 周后，BMSCs 已形成了成熟的軟骨組織，并能大量分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)（圖2）。

圖2 BMSCs 體外構(gòu)建軟骨大體觀及組織學(xué)檢測(cè)Fig.2 Gross observation and histological detection of cartilage constructed by BMSCs in vitro

2.2 軟骨修復(fù)大體觀

實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)均有新生軟骨組織形成，其表面光滑，色澤、質(zhì)地、強(qiáng)度與周?chē)＼浌穷?lèi)似。剖面觀可見(jiàn)新生軟骨組織與周?chē)＼浌墙M織及軟骨下骨組織界面愈合良好，且修復(fù)區(qū)軟骨厚度與周?chē)ｊP(guān)節(jié)軟骨未見(jiàn)明顯差異。單純材料組缺損邊緣雖有少量軟骨細(xì)胞爬入，但中央?yún)^(qū)主要表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織樣組織修復(fù)，關(guān)節(jié)面軟骨負(fù)重區(qū)多有磨損變薄、軟骨下骨隱約可見(jiàn)，出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。這些結(jié)果說(shuō)明，BMSCs 體外構(gòu)建軟骨可修復(fù)自體關(guān)節(jié)軟骨缺損，可有效避免或延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。統(tǒng)計(jì)修復(fù)率結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組基本修復(fù)；單純材料組僅1 例有部分缺損修復(fù)；空白對(duì)照組均無(wú)修復(fù)（圖3、4）。

圖3 術(shù)后6 個(gè)月取材大體觀及剖面觀Fig.3 Gross and cross section view of repaired defects 6 months after operation

2.3 骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)

術(shù)后6 個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中IGF-1 水平顯著高于空白對(duì)照組和單純材料組（P＜0.05）；而IL-1β、MMP-13、TNF-α 的表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組和單純材料組（P＜0.05）。提示BMSCs 體外構(gòu)建軟骨不僅可以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，還能有效減緩或避免骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展（圖5）。

圖5 關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子的變化情況Fig.5 Changes of cytokines in joint fluid

3 討論

組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損尚停滯于臨床前的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用BMSCs 體外構(gòu)建的組織工程軟骨可成功修復(fù)豬自體的關(guān)節(jié)軟骨缺損，且新生軟骨組織與周?chē)５墓恰④浌墙M織界面愈合良好，其組織學(xué)特性與天然軟骨也十分接近。更重要的是，組織工程軟骨修復(fù)軟骨缺損后能有效減緩或避免骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。

軟骨損傷是常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)損傷之一，尤其是關(guān)節(jié)軟骨損傷。隨著人口老齡化趨勢(shì)的發(fā)展，關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的軟骨缺損也在逐年劇增。本研究發(fā)現(xiàn)，利用豬自體的BMSCs 可在體外構(gòu)建成熟穩(wěn)定的軟骨組織，同時(shí)根據(jù)缺損的大小與形狀，還可以在體外構(gòu)建出個(gè)性化的具有特定形態(tài)且功能正常的軟骨組織；且這些組織工程軟骨能有效修復(fù)自體關(guān)節(jié)軟骨缺損。這為組織工程軟骨的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

盡管大部分BMSCs 構(gòu)建的軟骨植入體內(nèi)后都獲得了較為理想的軟骨再生效果，但我們也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中有些個(gè)體的修復(fù)效果未盡如人意，出現(xiàn)了纖維結(jié)締組織樣修復(fù)并伴有骨關(guān)節(jié)炎樣表現(xiàn)。根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)導(dǎo)致軟骨缺損修復(fù)效果欠佳的原因可能有以下幾方面：①軟骨下骨出血。為了能植入厚度約為3 mm 的軟骨組織，術(shù)中我們刮除了厚度約0.5 mm 的軟骨下骨組織。刮除軟骨下骨過(guò)程中出血量大，止血困難，將組織工程軟骨植入軟骨缺損區(qū)后，軟骨下骨仍繼續(xù)出血，直至將軟骨充分固定后出血才停止。因此，植入的組織工程軟骨與軟骨下骨之間有較大的血腫存在。文獻(xiàn)報(bào)道，軟骨修復(fù)手術(shù)造成的滑膜、軟骨下骨出血會(huì)刺激創(chuàng)面大量白細(xì)胞滲出并釋放大量的炎癥因子，而導(dǎo)致軟組織反應(yīng)性水腫和關(guān)節(jié)積液；此外，關(guān)節(jié)內(nèi)積血還導(dǎo)致纖溶酶激活。這些因素破壞了關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。軟骨由于沒(méi)有血供，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于關(guān)節(jié)液，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的紊亂干擾了軟骨、軟骨下骨的正常營(yíng)養(yǎng)成分供給，導(dǎo)致軟骨無(wú)法獲得正常的營(yíng)養(yǎng)，從而影響植入軟骨的進(jìn)一步成熟[8]，影響修復(fù)效果。②手術(shù)創(chuàng)傷過(guò)大，植入物缺乏合適力學(xué)刺激微環(huán)境。本研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的股骨髁均同時(shí)做了大面積（直徑10 mm）全厚軟骨缺損，損傷較大。軟骨基質(zhì)中的GAG 有吸水膨脹的特性，使得軟骨像海綿一樣，在不受到壓力時(shí)能源源不斷地將關(guān)節(jié)液中的營(yíng)養(yǎng)成分吸入軟骨組織內(nèi)，而在受壓變形時(shí)又可將代謝產(chǎn)物與關(guān)節(jié)液擠出軟骨組織從而排出代謝產(chǎn)物。因此，適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激對(duì)軟骨的營(yíng)養(yǎng)代謝至關(guān)重要。但是，術(shù)后軟骨下骨淤血、關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液等不僅引起關(guān)節(jié)腔內(nèi)結(jié)締組織增生、黏連，還可引起關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓、骨內(nèi)壓增高[9-10]，加重了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后的疼痛感，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)減少，進(jìn)一步加重了術(shù)后關(guān)節(jié)黏連[11]。由于缺乏合適的力學(xué)刺激，從而大大影響了軟骨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入及代謝產(chǎn)物的排出。這些因素相互作用加重了關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境紊亂，嚴(yán)重影響植入軟骨的營(yíng)養(yǎng)代謝和物質(zhì)運(yùn)輸，從而影響修復(fù)效果。③另一個(gè)重要影響因素是動(dòng)物術(shù)后負(fù)重過(guò)早。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙下肢的內(nèi)外側(cè)髁同時(shí)做軟骨修復(fù)手術(shù)，為維持基本生活，大部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后1 周內(nèi)開(kāi)始負(fù)重，而目前臨床上自體關(guān)節(jié)軟骨移植手術(shù)普遍實(shí)行術(shù)后早期被動(dòng)活動(dòng)、術(shù)后6 周開(kāi)始負(fù)重。從體外構(gòu)建軟骨的彈性模量來(lái)看，體外構(gòu)建8 周的軟骨，其彈性模量只達(dá)到正常關(guān)節(jié)軟骨的30.61%，抗壓強(qiáng)度遠(yuǎn)低于正常關(guān)節(jié)軟骨，這間接說(shuō)明了體外構(gòu)建的軟骨并不足以承重[12-14]。因此，術(shù)后負(fù)重過(guò)早或?qū)е铝酥踩氲能浌鞘艿竭^(guò)大的壓強(qiáng)，使其膠原纖維斷裂、結(jié)構(gòu)破壞，而影響修復(fù)效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了應(yīng)用自體BMSCs 體外構(gòu)建的組織工程軟骨，能有效修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)大面積全厚關(guān)節(jié)軟骨缺損，但是由于受手術(shù)創(chuàng)傷、術(shù)后關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境變化、過(guò)早負(fù)重等因素影響，其修復(fù)效果有待進(jìn)一步提高。此外，影響關(guān)節(jié)修復(fù)效果的關(guān)鍵因素及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為組織工程軟骨的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。