蜂毒化學(xué)成分的分離方法研究進(jìn)展

陳艷娥，杜曉紅，吳國(guó)泰，

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

蜂毒是我國(guó)傳統(tǒng)中藥的寶貴資源，也是重要的蜂產(chǎn)品之一。中醫(yī)認(rèn)為蜂毒具有祛風(fēng)、止痛、平喘的功效，現(xiàn)代藥理活性主要是鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用、擴(kuò)張血管、降低血壓、抗心律失常、改善冠狀動(dòng)脈供血和微循環(huán)的作用，還具有抗炎、抗菌、溶血、抗凝血、抗病毒以及防輻射等作用，可用于治療風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，神經(jīng)炎，皮膚病等常見(jiàn)疾病。蜂毒主要含有蛋白質(zhì)類(lèi)、 肽類(lèi)、生物胺類(lèi)及其它未知成分，已被確定的功能物質(zhì)有溶血肽、蜂毒明肽、鎮(zhèn)靜肽、磷酸脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、乙酸異戊酯及近60 種酶類(lèi)。蜂毒活性成分的分析分離成為近幾年的研究熱點(diǎn)，主要方法和關(guān)鍵技術(shù)綜述如下。

1 電泳法

李榮麗等[1]采用凝膠電泳和非凝膠技術(shù)對(duì)毒腺蜂毒和電取蜂毒的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，對(duì)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、功能鑒定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在毒腺蜂毒中存在30 種非冗余蛋白質(zhì)，其中蜂毒毒素占50%，腺體保護(hù)蛋白和蜂毒毒素合成相關(guān)蛋白占50%；在電取蜂毒中存在14 種非冗余蛋白質(zhì)，主要是蜂毒毒素成分，占93%；該研究在2 種蜂毒中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)磷脂酶A2，在毒腺蜂毒中發(fā)現(xiàn)了肽基輔氨酰順?lè)串悩?gòu)酶。本研究發(fā)現(xiàn)蜂毒明肽前蛋白原、鎮(zhèn)靜肽在毒腺蜂毒中的含量顯著高于電取蜂毒，磷脂酶A2、毒液二肽基肽酶Ⅳ前體、毒液過(guò)敏性酸性磷酸酶和肥大細(xì)胞脫粒肽在電取蜂毒中含量較高，提示電擊取毒可盡可能獲得較多的蜂毒毒素。

2 色譜法

陳丹[2]采用制備HPLC 技術(shù)分離純化了胡蜂毒的主要成分，并利用現(xiàn)代波譜技術(shù)和測(cè)序技術(shù)完成了各主要成分的結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胡蜂毒中含有氨基酸、多肽蛋白類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)和芳香仲胺類(lèi)物質(zhì)，不含有還原糖和苷類(lèi)物質(zhì)，對(duì)總多肽蛋白、游離氨基酸和多糖含量測(cè)定的研究結(jié)果表明，胡蜂毒含有豐富的蛋白多肽類(lèi)物質(zhì)以及游離氨基酸和多糖類(lèi)成分，含量分別為56.28%、9.35%、15.95%。進(jìn)一步研究得到6 個(gè)純度均在98%以上的主要成分，占蜂毒含量約為86%。根據(jù)色譜峰保留時(shí)間依次命名為A、B、C、D、E、F，分子質(zhì)量分別為111、176、1360、1478、33217、1381，其中A、B 屬于胺類(lèi)及生物堿類(lèi)成分，C、D、F 為生物活性小肽，E 為生物活性蛋白家族亞型。

毛兵[3]采用高速逆流色譜建立一種新的分離蜂毒肽方法，可用于鑒定蜂毒肽的分子量及氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)，此方法成本低，樣品無(wú)需前處理，所得產(chǎn)物不需后續(xù)處理，增加了一次分離量。對(duì)最佳分離條件（HSCCC 螺旋管轉(zhuǎn)數(shù)為850 rmp、流動(dòng)相流速為1 mL/min 及循環(huán)水浴溫度為25℃） 下的分離產(chǎn)物進(jìn)行分子量測(cè)定，分子量為2845，并根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定得知所得分離產(chǎn)物為蜂毒肽。

Zenon[4]通過(guò)建立新的液相色譜法對(duì)蜂毒成分進(jìn)行分析，解決了磷酸脂酯A2 與蜂毒溶血肽不易分離的問(wèn)題。

孟迂[5]綜合運(yùn)用多種色譜技術(shù)，從我國(guó)產(chǎn)意大利蜜蜂蜂毒中共分離得到10 個(gè)蜂毒毒素，通過(guò)進(jìn)一步研究確定了這些蜂毒毒素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其中3 個(gè)為新的蜂毒毒素，分別命名為melittin F1，secapin-1 和secapin-2。secapin-1、secapin-2 與已知多肽secapin的區(qū)別主要集中在第4 位、第16 位及第19 位氨基酸殘基上。另有5 個(gè)蜂毒毒素通過(guò)測(cè)定LC-ESI-Q-TOF的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到鑒定，分別命名為melittin F2、melittin F3、melittin F4、melittin 及melittin-G，其中melittin 為已知多肽，其它4 個(gè)多肽尚無(wú)天然存在的報(bào)道。進(jìn)一步的研究表明，此種蜂毒中多為小分子量多肽，分子量范圍主要在1000-3500 之間。能檢測(cè)到的分子量大于5000 的多肽數(shù)量較少。

3 層析法

楊文超[6]使用QF-1 型超級(jí)蜜蜂電子自動(dòng)取毒器獲取意蜂蜂毒，經(jīng)葡聚糖凝膠層析等分離純化后，再經(jīng)電泳對(duì)組分進(jìn)行鑒定，證實(shí)該物質(zhì)是蜂毒肽，是蜂毒主要組成成分及活性成分，是一種含有26 個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子抗菌肽。物質(zhì)分子量為3000Da 左右，純度為電泳級(jí)。

曾琳等[7]通過(guò)葡聚糖凝膠G-75 分子篩柱和肝素親和柱兩步分離純化，成功從黑尾胡蜂蜂毒中純化到了1 個(gè)磷脂酶活性組分，相對(duì)分子質(zhì)量約為32000，命名為Vtp32。肽指紋圖譜分析及N 端氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示Vtp32 與Vespa 屬胡蜂磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)具有高度的序列相似性。因Vtp32 可以特異性水解磷脂的sn-1 位，故Vtp32 為黑尾胡蜂PLA1。

余曉東等[8]用Sephadex G-25、Sephadex G-50、Celluose CM32 三步層析法從意蜂蜂毒中分離純化得到Melittin 活性組分，其分子量為3000，由26 個(gè)氨基酸殘基組成，富含中性氨基酸而不含Cys、Asp、Met、Tyr、Phe、His 六種氨基酸殘基。

4 丙酮提取法

粗蜂毒多數(shù)采用層析分離的方法進(jìn)行提純，為縮短生產(chǎn)周期、節(jié)約成本，俞玉忠等[9]用丙酮提取法進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果顯示，用丙酮處理后的蜂毒不僅能把蜂蜜去除干凈顯示三條清晰的電泳色帶，還使蜂毒的pH 值從4. 8 上升到5. 4，溶血活力從52 %提高到90 %，水分含量從8.2 %下降到2.4%，得率達(dá)到87.3%，這說(shuō)明用丙酮法替代層析法是可行的。

5 多技術(shù)聯(lián)用法

徐彭等[10]采用溶媒萃取、化學(xué)裂解和兩次凝膠過(guò)濾柱層析，從蜂毒中得到電泳純的蜂毒肽，其等電點(diǎn)為10.5，約占蜂毒干重的50%，是一種含有26 個(gè)氨基酸的小分子多肽。

孫敏[11]經(jīng)Sephadex 凝膠、醇沉、反相高效液相色譜(RT-HPLC)優(yōu)化分離純化條件提純蜜蜂蜂毒。通過(guò)Sephadex G-25 凝膠（以流速28 mL/h、上樣量1.0 m L、上樣濃度1.0 mg/mL） 獲得兩個(gè)組分P1、P2。收集P1 組分進(jìn)行冷凍干燥，用3 倍體積無(wú)水乙醇沉淀，3000 r/min 離心5 min，沉淀即為蜂毒肽，測(cè)得蜂毒肽的相對(duì)分子量為2840Da 左右，提取率為96%，純度為98%；上清經(jīng)RT-HPLC，色譜柱Zorbax SB-C18(4.6×250μm)、進(jìn)樣量10μL、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相，得到三種組分Q1、Q2、Q3，分別為肥大細(xì)胞脫粒肽(MCD 肽)、蜂毒明肽、鎮(zhèn)靜肽，相對(duì)分子量分別為2592 Da、2035 Da、2700 Da 左右，提取率分別為78.6%、89%、70%，其中MCD 肽和蜂毒明肽純度分別為91.28%、90.16%。

朱偉等[12]利用利用凝膠過(guò)濾層析、肝素親和柱層析、高效液相色譜等方法分離蜂毒多肽，得到的BVI-2H 是蜂毒多肽混合物，其主要成分的分子量為644.8 U。

黃永楷等[13]采用sephadex G-50F 柱層析及CM-sephadex C-50 離子交換柱梯度洗脫法，從蜂毒中分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組分，其中Ⅱ峰量較多，生物活性較強(qiáng)，且有3 個(gè)蛋白吸收峰Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc。

張海花等[14]運(yùn)用高分子電解質(zhì)聚丙烯酸選擇性沉淀蜂毒堿性多肽，通過(guò)Sephadex G -5 凝膠層析分離堿性多肽。研究表明，堿性多肽的等電點(diǎn)pI 為9.0，分子量約為2800 Da。

張文文等[15]開(kāi)發(fā)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)電擊蜂毒中的組織胺、多巴胺、5- 羥色胺、腎上腺素和去甲腎上腺素進(jìn)行測(cè)定。研究表明蜂毒樣品中的五種生物胺在0.5 ～1000 ng／kg 范圍內(nèi)線性良好，R＞0.998，檢測(cè)限和定量限范圍分別為0.09～0.17ng／kg和0.30～0.59 ng／kg，在線性范圍內(nèi)的平均回收率范圍為80.9 ～ll1.4%，日內(nèi)RSD＜7.51%，日間RSD＜10.17%。此方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性，并且簡(jiǎn)單快速、綠色環(huán)保。

Simona 等[16]采用高分辨率質(zhì)譜圖像新技術(shù)可對(duì)蜂毒進(jìn)行有效分離還能測(cè)定主要成分的百分含量。在對(duì)蜂毒肽的分離、純化與生物化學(xué)特性研究中，也發(fā)現(xiàn)一種新的肽，具有較弱的溶血性，且該物質(zhì)的最大含量期出現(xiàn)在冬季的幾個(gè)月份。

隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，更有效的分離，鑒定及分析蜂毒成分的方法將不斷涌現(xiàn)，蜂毒在醫(yī)藥、臨床及農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治上的廣泛應(yīng)用將明顯拓寬，蜂毒的活性、功能機(jī)理和藥用開(kāi)發(fā)等研究將進(jìn)一步補(bǔ)充與完善。