禾谷炭疽菌CgRab5A的亞細(xì)胞定位研究

劉涵 孟成真 劉玉青 李秀紅 石曉玲 齊堯堯 張桂玲

摘 要：為明確禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）中CgRab5A（GLRG_00019）蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位特點(diǎn)，利用多片段一步克隆法將CgRab5A自身啟動子、GFP片段和CgRab5A開放閱讀框（ORF）片段克隆到pKNT載體上，轉(zhuǎn)化野生型禾谷炭疽菌的原生質(zhì)體后，通過新霉素抗性篩選獲得陽性候選轉(zhuǎn)化子，利用共聚焦顯微鏡觀察GFP-CgRab5A在菌絲和孢子內(nèi)的定位情況。結(jié)果表明，一步克隆法獲得的pKNT-GFP-CgRab5A重組載體經(jīng)測序后序列完全正確，亞細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn)GFP-CgRab5A在菌絲和孢子細(xì)胞內(nèi)均呈點(diǎn)狀分布，定位于早期內(nèi)涵體上，暗示其可能參與早期內(nèi)涵體的相關(guān)調(diào)控過程。

關(guān)鍵詞：禾谷炭疽菌;CgRab5A;亞細(xì)胞定位

中圖分類號 S432.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0099-04

Study on Subcellular Localization of CgRab5A In Colletotrichum graminicola

Liu Han et al.

（College of Agriculture and Forestry Science，Linyi University，Linyi 276000，China）

Abstract：In order to clarify the cellular characteristics of CgRab5A （GLRG_00019） from Colletotrichum graminicola，firstly native promoter and ORF of CgRab5A，GFP were cloned to pKNT vector by multis one step cloning method. And then the recombinant plasmid was transferred to protoplast of wild type C. graminicola and positive candidates were screened by neomycin resistance. Finally，the localization of GFP-CgRab5A in mycelia and spores was observed by confocal microscope. The results showed that the recombinant vector of pKNT-GFP-CgRab5A was completely right by sequencing，and the subcellular localization observation showed that GFP-CgRab5A was distributed in the mycelia and spore cells in a spot-like manner and located on the early endosomes，suggesting that it may play important roles in regulating early endosome. This study provided clues for the further analysis of the functions of CgRab5A，and also lays a theoretical foundation for illuminating of the pathogenic mechanism of C. graminicola.

Key words：C. graminicola;CgRab5A;Subcellular localization

1 前言

炭疽菌（Colletotrichum）是一種廣泛分布于全球的真菌，約有600多個屬，能侵染超過3200種植物，包括重要的農(nóng)作物如玉米和高粱[1]，因此被評為全球最重要的植物病原真菌之一[2]。禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）是一種半活體營養(yǎng)型真菌，能引起玉米的葉枯病和莖腐病，據(jù)估計，每年給玉米產(chǎn)地造成的損失高達(dá)40%，相當(dāng)于美國一年損失10億美元[3]。該病原菌能侵染玉米不同的組織，像葉片、莖稈、根部，在病死植株上腐生越冬作為來年的侵染源[4，5]。禾谷炭疽菌在侵入植物、擴(kuò)展蔓延和病害發(fā)生的整個過程涉及到復(fù)雜的蛋白運(yùn)輸過程，然而Rab蛋白作為蛋白運(yùn)輸?shù)暮诵恼{(diào)控因子，其具體功能尚未明確。

Rab蛋白作為分子開關(guān)，通過與上游調(diào)控因子和下游效應(yīng)因子的相互作用，實(shí)現(xiàn)GTP激活態(tài)和GDP失活態(tài)的轉(zhuǎn)變，調(diào)控囊泡的出芽、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定與融合等胞吞和胞吐的各個過程[6]。其成員Rab5在真核細(xì)胞內(nèi)是高度保守的，在動物、植物和真菌中均有研究。在哺乳動物中參與早期胞吞作用的多個過程，包括網(wǎng)格衣殼蛋白內(nèi)吞囊泡的形成和脫殼、囊泡與早期內(nèi)涵體的融合、早期內(nèi)涵體在細(xì)胞骨架上的移動以及利用與效應(yīng)因子相互作用完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，還有自噬作用、染色體線性化等過程[7-9]。近來研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在絲狀真菌的生長發(fā)育和侵染致病過程中發(fā)揮重要作用。在構(gòu)巢曲霉中，RabA和RabB分別是Ypt51和Ypt52的同源蛋白，兩者都定位于早期內(nèi)涵體上，功能存在重疊，ΔrabA和ΔrabB都影響構(gòu)巢曲霉的生長，但只有ΔrabB阻礙早期內(nèi)涵體的移動，是早期內(nèi)涵體降解的唯一中介。此外，RabB和RabA（較小程度）能招募CORVET復(fù)合體到內(nèi)涵體膜上[10-11]。最近禾谷鐮刀菌鑒定出2個Rab5同源蛋白（FgRab51和FgRab52）均定位于早期內(nèi)涵體上，這2個蛋白功能存在冗余，缺失后都影響了菌絲的生長、孢子萌發(fā)和致病性，但是FgRAB52對生長發(fā)育更為重要[12]。稻瘟病菌含有酵母Ypt51和Ypt52的同源蛋白MoRab5A和MoRab5B，盡管兩者都定位于早期內(nèi)涵體上，共同參與稻瘟病菌的生長發(fā)育、產(chǎn)孢過程、黑色素合成、液泡融合、胞吞作用、有性生殖和致病過程，但兩者的生化特點(diǎn)不同，獨(dú)立發(fā)揮作用[13-14]。

本課題組前期通過生物信息學(xué)的方法鑒定出禾谷炭疽菌Rab5的1個同源蛋白CgRab5A[15]，共含有237個氨基酸，長度714bp，利用在線軟件預(yù)測該蛋白主要定位于高爾基體，與文獻(xiàn)報道不相符。為了明確該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體分布特點(diǎn)，本研究利用共聚焦顯微鏡觀察其亞細(xì)胞定位，旨在為深入分析其具體功能奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 禾谷炭疽菌菌株和載體 禾谷炭疽菌的菌株M2由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的劉文德研究員惠贈。pkNTG質(zhì)粒由福建農(nóng)林大學(xué)魯國東教授惠贈。

2.1.2 生化試劑 PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase和ClonExpress？MultiS One Step Cloning Kit均購自Vazyme公司，XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司;PCR擴(kuò)增Golden Easy PCR System、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、通用性DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根公司;溶壁酶和崩潰酶均購自Sigma公司;PEG3350和新霉素均購自生工生物工程（上海）有限公司。引物合成和測序分析均由擎科完成。

2.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：氯化鈉10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L（固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g/L）;

CMII培養(yǎng)基：20×硝酸鹽母液50mL/L、1000×微量元素母液1mL/L、維生素母液1mL/L;葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、酸水解酪蛋白1g/L（固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15g/L）。

20×硝酸鹽母液：硝酸鈉120g/L、氯化鉀10.4g/L、七水硫酸鎂10.4g/L、磷酸二氫鉀30.4g/L（高壓滅菌后4℃保存）;

1000×微量元素母液（100mL）：七水硫酸鋅2.2g、硼酸1.1g、四水氯化錳0.5g、七水硫酸亞鐵0.5g、六水氯化鈷0.17g、五水硫酸銅0.16g、二水錳酸鈉0.15g、乙二胺四乙酸四鈉5g（4℃保存）;

維生素母液（100mL）：生物素0.01g、維生素B0.01g、硫胺素0.01g/L、核黃素0.01g、對氨基甲苯0.01g、煙酸0.01g（棕色瓶4℃保存）。

TB3培養(yǎng)基：蔗糖200g/L、酵母提取物3g/L、胰蛋白胨3g/L（固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉15g/L）

2.2 方法

2.2.1 引物的設(shè)計 首先利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/網(wǎng)站預(yù)測CgRab5A的啟動子，然后利用Primer5對啟動子區(qū)域、ORF區(qū)域和GFP進(jìn)行引物設(shè)計，最后在設(shè)計好的引物上添加GFP接頭和酶切位點(diǎn)。

2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 首先以野生型菌株CgM2的DNA為模板，根據(jù)PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase的反應(yīng)體系和條件，利用CgRab5A-PF/PR和OF/OR兩對引物分別擴(kuò)增CgRab5A的啟動子和ORF、GFP-F/R擴(kuò)增GFP片段;然后利用ClonExpress？MultiS重組克隆試劑盒將純化回收后的啟動子、GFP和ORF片段與XhoI/EcoRI雙酶切后的pKNT片段進(jìn)行連接;最后挑取單克隆，經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證后得到包含自身啟動子的GFP-CgRab5A重組質(zhì)粒，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化參考Wang[16]的方案稍作修改：（1）培養(yǎng)基換為CMII培養(yǎng)基;（2）裂解液為溶壁酶和崩潰酶，終濃度分別是為20和5mg/mL，裂解時間為4-6h;（3）抗性篩選為新霉素，下層終濃度為200μg/mL，上層濃度為400 μg/mL。

2.2.4 候選轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 首先利用無菌牙簽將上層菌落挑取到CMII固體培養(yǎng)基上，于26℃培養(yǎng)3d后刮取菌絲到含有石英砂的2.0mL離心管中;然后加入400μLDNA粗提buffer（1M Tris-HCl pH8.0、0.5M EDTA pH8.0、20%SDS、5M NaCl），渦旋混勻后，經(jīng)氯仿抽提和無水乙醇沉淀后，溶解于無菌水中;最后對DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中PCR體系（25μL）包括DNA模板10ng、引物pKNTG-F和CgRab5A-OR各0.2μ mol/L、2x Reaction Mix和Golden DNA Polymerase12.5μL，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s、60℃復(fù)性30s、72℃延伸5min15s、循環(huán)數(shù)為30，72℃延伸7min后于4℃保存。

2.2.5 亞細(xì)胞定位觀察 CgRab5A的亞細(xì)胞定位觀察是將候選轉(zhuǎn)化子挑取到CMII固體培養(yǎng)基上，4d后挑取菌絲到載玻片上，制備樣品。同時用膜結(jié)合染料FM4-64處理5min后于共聚焦顯微鏡下觀察CgRab5A與FM4-64的共定位情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 CgRab5A引物 本實(shí)驗(yàn)中用到的引物序列如表1所示。其中CgRab5A-PF/PR首先通過在線網(wǎng)站預(yù)測CgRab5A的啟動子可能在ORF區(qū)域上游2700bp左右的位置（Score值為1.084），因此選定ORF上游大概3000bp核苷酸用Primer5設(shè)計引物得到CgRab5A-PF/PR，并在其CgRab5A-PF前面加上pKNT XhoI無縫接頭序列GGGTACCGGGCCCCCCCTCGAG，在CgRab5A-PR前面加上GFP的前接頭TCCTCGCCCTTGCTCACCAT。GFP片段的擴(kuò)增引物GFP-F/R則是從GFP序列中起始密碼子和去除終止密碼子后開始各取20個堿基得到的。CgRab5A片段擴(kuò)增的前引物CgRab5A-OF是從起始密碼子開始取20個堿基，并在前面加上GFP的后接頭CACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAG獲得的，而擴(kuò)增的后引物則是用Primer 5 對CgRab5A的ORF和3′端UTR序列進(jìn)行設(shè)計獲得，并在CgRab5A-OR前面加上pKNT EcoRI無縫接頭CCCCCGGGCTGCAGGAATTC。

3.2 GFP、CgRab5A自身啟動子、ORF片段和pKNT載體 首先PCR擴(kuò)增GFP、CgRab5A自身啟動子和ORF片段各100μL，然后利用天根公司的DNA瓊脂糖膠回收試劑盒純化回收得到35μLDNA片段，取3μLDNA片段利用1%的瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果如圖1A所示，GFP大小為717bp，條帶介于500bp和800bp條帶之間，CgRab5A片段大小為1594bp大小介于800bp和2000bp之間，而啟動子大小為2740bp，條帶接近3000bp，結(jié)果表明這3個片段的大小與理論值一致，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

由于Rab蛋白的C末端含有異戊二烯化基序，與GFP等標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合時通常將標(biāo)簽加到N末端，因此本研究首先利用EcoRI和XhoI對pKNTG載體進(jìn)行雙酶切，切除容易連接到基因C末端的GFP標(biāo)簽，結(jié)果如圖1B所示，雙酶切可以看到pKNT和GFP兩條帶，切取pKNT片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，取3μL利用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA，結(jié)果如圖1B所示，pKNT片段大于4500bp，大小正確。

A. PCR擴(kuò)增片段，B. 載體雙酶切

3.3 pKNT-GFP-CgRab5A重組載體 將上述得到的pKNT載體、啟動子、GFP片段和CgRab5A片段根據(jù)ClonExpress？MultiS One Step Cloning Kit的說明進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆用CgRab5A-PF/OR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，共挑取8個單克隆進(jìn)行PCR，只有第2個單克隆大小與理論值（5051bp）不符，最終挑取第1、5和6等3個克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行測序（測通），發(fā)現(xiàn)第1個克隆序列完全正確，命名為pKNT-GFP-CgRab5B-1，提取質(zhì)粒用于后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

M：Marker III

3.4 GFP-CgRab5A陽性轉(zhuǎn)化子 將pKNT-GFP-CgRab5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型禾谷炭疽菌CgM2的原生質(zhì)體中，通過新霉素篩選共獲得12個候選轉(zhuǎn)化子，利用CTAB粗提法提取候選轉(zhuǎn)化子的DNA，結(jié)果如圖3A所示，12個候選轉(zhuǎn)化子的DNA條帶清晰，大小正確。進(jìn)而利用引物pKNTG-F和CgRab5A-OR對候選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3B所示，除了第2個轉(zhuǎn)化子沒有擴(kuò)增到之外，其他11個轉(zhuǎn)化子都大小與理論值一致。

A：DNA提取，B：PCR驗(yàn)證

3.5 GFP-CgRab5A的定位 FM4-64作為內(nèi)膜系統(tǒng)的標(biāo)記染料，因染色時間不同而定位于不同的內(nèi)膜上，其中染色時間較短時FM4-64首先進(jìn)入早期內(nèi)涵體[17]。本研究用FM4-64染色5min后于共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)無論是菌絲還是孢子，GFP-CgRab5A都呈點(diǎn)狀分布，能與FM4-64共定位（箭頭所示），表明GFP-CgRab5A主要定位于早期內(nèi)涵體上。

4 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位決定其生物學(xué)功能，因此明確禾谷炭疽菌中CgRab5A在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位有助于解析其生物學(xué)功能。本研究根據(jù)一步克隆法構(gòu)建了GFP-CgRab5A融合蛋白載體，通過PCR驗(yàn)證獲得候選陽性轉(zhuǎn)化子后，利用共聚焦顯微鏡觀察到CgRab5A主要分布于早期內(nèi)涵體上呈點(diǎn)狀分布，這與之前其他絲狀真菌的研究報道是一致的[12-14]，表明該蛋白可能在禾谷炭疽菌的生長發(fā)育和侵染致病過程中發(fā)揮了重要作用。

前期的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CgRab5A含有Pro44氨基酸殘基，內(nèi)源GTPase活性可能較低，暗示其在與效應(yīng)蛋白的相互作用和早期內(nèi)涵體分揀過程中發(fā)揮作用，但具體的功能還有待于進(jìn)一步研究。盡管Rab5家族在序列上是高度保守的，但是其成員之間的功能在不同的絲狀真菌中卻不盡相同。例如，禾谷鐮刀菌中的FgRab51和FgRab52的功能存在冗余[12]，而稻瘟病菌中的MoRab5A和MoRab5B生化功能不同[13]，在稻瘟病菌的生長發(fā)育和侵染致病過程中獨(dú)立發(fā)揮作用[14]。禾谷炭疽菌中CgRab5A和CgRab5B兩者的具體功能如何，兩者是否像已報道的研究中那樣存在獨(dú)立或冗余的功能，亦或者有不同于已有報道的獨(dú)特的功能，這些都值得深入探究。

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（責(zé)編：張 麗）