不同煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)的倉(cāng)間空氣霉菌組成差異分析

姜振錕 劉景川 陳善義 李菁菁 何偉 張?jiān)龌? 沈祿恒

摘 要：為明確片煙醇化倉(cāng)庫(kù)倉(cāng)間空氣中含有的霉菌種類和組成，以龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司東肖煙葉庫(kù)3個(gè)倉(cāng)庫(kù)為研究對(duì)象，采用空氣微生物采樣器進(jìn)行浮游霉菌采樣，所得的霉菌平板經(jīng)28℃下培養(yǎng)4d后計(jì)數(shù)，挑取菌落并進(jìn)行ITS測(cè)序，分析不同煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)的倉(cāng)間空氣浮游霉菌的組成差異。結(jié)果表明，相對(duì)濕度大的倉(cāng)庫(kù)，其倉(cāng)間空氣中含有的霉菌數(shù)量多;3個(gè)倉(cāng)庫(kù)倉(cāng)間空氣中收集獲得的霉菌共有15個(gè)種，含量占比在25%以上的霉菌為極細(xì)枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉;極細(xì)枝孢為4號(hào)庫(kù)的優(yōu)勢(shì)霉菌，而枝狀枝孢菌為9號(hào)庫(kù)、13號(hào)庫(kù)的優(yōu)勢(shì)霉菌。

關(guān)鍵詞：霉菌;微生物區(qū)系;片煙;倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)

中圖分類號(hào) S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）22-0040-02

在卷煙生產(chǎn)加工過(guò)程中，復(fù)烤后的片煙倉(cāng)儲(chǔ)醇化是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。片煙自然醇化周期較長(zhǎng)，通常為12～30個(gè)月[1-3]?？諝庵写嬖谥喾N霉菌，片煙在倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程易沾染霉菌孢子，由于煙葉中含有霉菌生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)、還原糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再加上煙葉本身吸濕性強(qiáng)，一旦條件適宜，易發(fā)生霉變[4]，嚴(yán)重影響煙葉的使用價(jià)值。有關(guān)片煙霉變微生物的區(qū)系研究，目前主要集中在片煙本身含有的霉菌，而對(duì)于倉(cāng)儲(chǔ)醇化過(guò)程中倉(cāng)間空氣霉菌的研究甚少。為此，本研究以龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司煙葉倉(cāng)庫(kù)為試驗(yàn)對(duì)象，利用空氣微生物采樣器采集倉(cāng)庫(kù)倉(cāng)間空氣霉菌孢子，分析不同倉(cāng)庫(kù)空氣霉菌的組成差異，旨在為片煙霉變的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基：購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號(hào)021115），按廠家說(shuō)明書(shū)配制，121℃下滅菌15min后，冷卻至約65℃時(shí)，向培養(yǎng)基中加入硫酸鏈霉素（終濃度為50μg/mL）。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號(hào)021041），按廠家說(shuō)明書(shū)配制，121℃下滅菌15min。儀器：空氣微生物采樣器（MAS-100NT型，Millipore公司，瑞士）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（CLC-B2V-M/CLC 222-TV型，MMM Group公司，德國(guó)）。

1.2 方法 采樣地點(diǎn)位于龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司東肖煙葉倉(cāng)庫(kù)4號(hào)（2001年建成，密封條件較差）、9號(hào)（2008年建成，密封條件較好）、13號(hào)（2010年建成，密封條件中等）醇化庫(kù)，所選樓層均為3樓（3個(gè)倉(cāng)庫(kù)總樓層數(shù)均為5層）。以DG18培養(yǎng)基為霉菌收集培養(yǎng)基，利用MAS-100NT空氣采樣器進(jìn)行倉(cāng)間空氣霉菌采樣，采樣體積為100L，每個(gè)倉(cāng)庫(kù)重復(fù)3次。采樣時(shí)，利用手持式溫濕度儀測(cè)量并記錄倉(cāng)間空氣的溫濕度。采樣結(jié)束后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，所得微生物平板帶回實(shí)驗(yàn)室，于28℃下培養(yǎng)4d后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落數(shù)。挑取菌落形態(tài)及顏色差異較大的菌落，轉(zhuǎn)移至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)4d。重復(fù)上述傳代過(guò)程，直至長(zhǎng)出的菌落形態(tài)單一，以實(shí)現(xiàn)菌落的純化。純化好的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行ITS測(cè)序，所得序列于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。用MEGA X軟件[5]自帶的Clustal W模塊對(duì)所得霉菌ITS序列進(jìn)行多重比對(duì)。然后通過(guò)MEGA X軟件中的Maximum Composite Likelihood模型計(jì)算進(jìn)化距離，利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)的霉菌數(shù)量 由表1可知，就溫度而言，采樣時(shí)3個(gè)倉(cāng)庫(kù)空氣溫度差異不大。相對(duì)濕度方面，4號(hào)庫(kù)最大、9號(hào)庫(kù)最小、13號(hào)庫(kù)居中。相應(yīng)地，4號(hào)庫(kù)平均的霉菌含量最大、9號(hào)庫(kù)最小、13號(hào)庫(kù)居中。3個(gè)倉(cāng)庫(kù)霉菌含量彼此之間差異顯著，且4號(hào)庫(kù)與其余2個(gè)倉(cāng)庫(kù)差異達(dá)到極顯著水平。這說(shuō)明倉(cāng)間空氣中霉菌的含量與空氣相對(duì)濕度關(guān)系密切。

2.2 不同煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)的霉菌組成差異 由表2～4可知，4號(hào)庫(kù)倉(cāng)間空氣含有6種霉菌，分別為極細(xì)枝孢、Cladosporium xanthochromaticum、菌核青霉菌、擬粉紅鎖擲孢酵母、裂褶菌以及小孢擬盤(pán)多毛孢，其中極細(xì)枝孢為優(yōu)勢(shì)菌，占比為83.58%;9號(hào)庫(kù)倉(cāng)間空氣含有5種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、短密青霉菌、裂褶菌、小孢擬盤(pán)多毛孢以及Penicillium virgatum，其中枝狀枝孢菌為優(yōu)勢(shì)菌，占比為81.40%;13號(hào)庫(kù)倉(cāng)間空氣含有4種霉菌，分別為枝狀枝孢菌、桔青霉、頂青霉及鮮紅青霉，其中枝狀枝孢菌為優(yōu)勢(shì)菌，占比為66.67%。此外，4號(hào)、9號(hào)庫(kù)共同含有的霉菌種類為裂褶菌和小孢擬盤(pán)多毛孢，9號(hào)、13號(hào)庫(kù)共同含有的霉菌為枝狀枝孢菌。

2.3 東肖煙葉倉(cāng)庫(kù)倉(cāng)間空氣中霉菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 由圖1可知，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)倉(cāng)間空氣分離所得菌株共有15個(gè)種。所得的15種霉菌在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上形成2大分支，其中4號(hào)庫(kù)的DX4-5菌株獨(dú)立形成1個(gè)大的分支，其余14種霉菌另形成1個(gè)大的分支，說(shuō)明DX4-5菌株與其余14個(gè)種菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

對(duì)比3個(gè)倉(cāng)庫(kù)的溫濕度條件和霉菌數(shù)量可以得知，倉(cāng)庫(kù)條件和倉(cāng)間環(huán)境的濕度對(duì)倉(cāng)間空氣霉菌數(shù)量的影響較大。倉(cāng)庫(kù)條件好、濕度較低的情況下，空氣中的霉菌數(shù)量明顯少于倉(cāng)庫(kù)條件差、濕度較高的倉(cāng)庫(kù)。因此，控制倉(cāng)庫(kù)的環(huán)境濕度可有效減少空氣中霉菌的數(shù)量，進(jìn)而降低倉(cāng)儲(chǔ)片煙霉變的風(fēng)險(xiǎn)。ITS測(cè)序及BLAST比對(duì)結(jié)果表明，極細(xì)枝孢、枝狀枝孢菌和桔青霉為相對(duì)的優(yōu)勢(shì)霉菌，不同倉(cāng)庫(kù)的倉(cāng)間空氣霉菌組成有所差異。下一步應(yīng)開(kāi)展上述優(yōu)勢(shì)霉菌的生物學(xué)特性及致霉條件的研究，以期為倉(cāng)儲(chǔ)片煙的霉變控制提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（FJZYKJJH2018011）。

作者簡(jiǎn)介：姜振錕（1994—），男，福建永定人，助理工程師，從事煙草原料研究工作。劉景川（1988—），男，福建龍巖人，助理農(nóng)藝師，從事煙草原料研究工作。#共同第一作者 *通訊作者? 收稿日期：2019-09-23