氮素水平對煙草幼苗生長發(fā)育及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

王菲 雷波 謝伶俐 李震 許本波

摘 要：采用盆栽種植，以煙草K326為試驗材料，CO（NH2）2為氮源，研究了4個氮素水平（0.1%、0.2%、0.3%和0.4%）對煙草生長發(fā)育及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明，高氮對煙草幼苗的生長發(fā)育造成了一定程度的脅迫，導(dǎo)致植株矮小，葉片發(fā)黃;隨著氮素處理水平的提高，煙堿含量下降，可溶性糖含量先下降后上升;谷氨酸合成酶活性先上升后下降，谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶呈上升的趨勢，硝酸還原酶活性先降低后升高;而淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性呈上升的趨勢。在高氮水平下，碳代謝活性增強，而氮代謝水平降低。相關(guān)分析表明，CO（NH2）2水平與煙堿含量呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：烤煙;碳氮代謝;硝酸還原酶;煙堿;可溶性糖

中圖分類號 S565.4;Q78文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0014-06

Effects of Nitrogen Levels on Seedlings Growth and Key Enzyme Activities for Carbon and Nitrogen Metabolism of Flue-cured Tobacco

Wang Fei1 et al.

（1College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China）

Abstract：In this experiment，the effects of differentnitrogen levels （0.1%，0.2%，0.3% and 0.4%） on the key enzyme activities of carbon and nitrogen metabolism of tobacco K326 was studied with potted planting based on CO（NH2）2. The results showed that high nitrogen leves inhibted tobacco plants growth and caused toyellow leaves. With the increase of nitrogen treatment level，nicotine content decreased and soluble sugar content first decreased and then increased. The activity of glutamate synthase first increased and then decreased，while that of glutamine synthase and glutamate dehydrogenase increased，and that of nitrate reductase decreased and then increased with increasing nitrogen level. The activities of amylase，sucrose invertase，sucrose synthase and sucrose phosphate synthase increased with increasing nitrogen level. All indicated high nitrogen level induced carbon metabolism，but inhited nitrogen metabolism. The correlation analysis showed that CO（NH2）2 level was negatively correlated with nicotine content.

Key words：Flue-cured tobacco;Carbon and nitrogen metabolism;Nitrate reductase;Nicotine;Soluble sugar

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，屬于雙子葉植物綱管花目茄科煙草屬，煙葉的品質(zhì)對煙草經(jīng)濟價值具有重要意義[1]。研究發(fā)現(xiàn)，碳、氮作為植物體內(nèi)主要的兩大元素，其代謝過程能夠直接或間接的影響煙草中相關(guān)物質(zhì)的化學(xué)組成，進而影響品質(zhì)[2]。碳氮代謝作為最基本的生理代謝，能夠影響礦質(zhì)元素的吸收、轉(zhuǎn)化、積累以及相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。碳氮代謝密切聯(lián)系，共同促進植物的生長發(fā)育，碳代謝過程中所固定的碳骨架與能量（ATP和GTP）能夠提供給氮代謝，而氮代謝所產(chǎn)生酶和蛋白又被碳代謝所需要[3]，碳氮代謝的協(xié)調(diào)程度關(guān)系到煙葉的產(chǎn)量的高低和品質(zhì)的優(yōu)劣。合適的碳氮比是氮代謝產(chǎn)物與碳代謝產(chǎn)物的集中體現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)的煙葉應(yīng)當(dāng)在合適的時期由氮代謝和碳的固定和轉(zhuǎn)化代謝為主轉(zhuǎn)變?yōu)樘嫉姆e累代謝為主[4-5]，2個代謝之間的協(xié)調(diào)程度直接關(guān)系到優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)。因此，研究不同施氮水平對煙草碳氮代謝的影響具有重要的理論和實際意義[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗在長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院人工氣候室中進行。供試烤煙品種為K326，采用土壤與基質(zhì)肥以1∶1比例混勻，測得混勻后土壤氮含量為0.1%。

1.2 試驗處理 將生長一致的6葉齡煙草幼苗移栽到添加不同氮素的基質(zhì)中進行不同水平氮素（CO（NH2）2）處理（0.1%、0.2%、0.3%和0.4%）。20d后，隨機挑選單株葉片（自下而上第3片葉）取樣，取樣后立即放置于-70℃環(huán)境中凍存，待測。

1.3 測定方法 分別采用提取脫色法[7]和蒽酮比色法[8]測量煙堿和可溶性還原糖含量;蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性測定采用3.5-二硝基水楊酸法[9];蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性測定采用Seger[10]和Bruskoya[11]等報道的分光光度計法;淀粉酶測定采用3.5-二硝基水楊酸法[12];硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）活性測定采用Krishna[13]、Singh[13]、Nagy[14]和Mathur[15]等報道的分光光度計法;活性測定采用等報道的方法。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS17.0和DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮素水平對煙株生長發(fā)育的影響 由圖1可知，不同施氮量處理植株20d后的表型特征差異明顯。與CK相比，土壤含氮量在0.2%時，植株生長緩慢，葉面積減少，葉片顏色加深;繼續(xù)提高土壤含氮量到0.3%時，植株幼小，生長受阻，葉面積繼續(xù)降低，葉片四周出現(xiàn)黃化;當(dāng)持續(xù)加大土壤含氮量到0.4%時，植株萎蔫，黃化，生長發(fā)育受到更為嚴(yán)重的迫害，幾乎致死。高氮脅迫下的煙草幼苗生長緩慢，體積減少50%以上，葉片含水量降低，植株的生理代謝過程受到影響。可見，各氮素處理間差異顯著，可用于探索高氮條件下煙草碳氮代謝之間的關(guān)系。

2.2 不同施氮素水平對煙株中煙堿和糖含量的影響 煙堿是煙草重要的生理活性物質(zhì)，煙葉中的煙堿含量直接決定著烤煙的品質(zhì)，是煙葉原料和卷煙產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個重要指標(biāo)。合適的煙堿含量是實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)低害烤煙生產(chǎn)的重要目標(biāo)。從圖2（a）可以看出，隨著施氮量的增加（氮素水平從0.1%增加到0.4%），煙葉中煙堿含量呈下降的趨勢。氮素水平為0.3%的時候，煙堿含量最低為0.58%;繼續(xù)提高氮素水平到0.4%，煙堿無顯著變化?？扇苄蕴鞘侵参镏饕獱I養(yǎng)物質(zhì)之一，其主要用于合成纖維素形成細(xì)胞壁，同時可溶性糖水合性強，可溶性糖含量的增加可以使植株滲透勢下降，有助于細(xì)胞或組織的持水，減少植物體細(xì)胞或組織所受到的傷害，提高植物的抗逆能力。由圖1可以看出，在高氮脅迫下，植株出現(xiàn)生長矮小，葉片含水量降低，同時葉片顏色加深。由圖2（b）發(fā)現(xiàn)，隨著施氮量的增加，可溶性糖含量逐漸降低，當(dāng)?shù)貪舛冗_到0.3%時，可溶性糖含量最低，含量只有0.36g/110g·FW。當(dāng)?shù)貪舛扔?.3%增加到0.4%時，可溶性糖含量開始升高，但仍顯著低于對照的，且葉片更容易受到機械損傷。

2.3 不同施氮量對糖代謝相關(guān)酶活性的影響 淀粉酶是碳水化合物中主要的酶類，可將葉綠體中積累的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，因而直接關(guān)系到植株體內(nèi)淀粉的積累量，從而影響光合碳代謝強度。由圖3（a）可知，隨著施氮量的增加，淀粉酶活性整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;氮素水平由0.1%增加到0.3%，淀粉酶活性有一定程度的下降，隨著氮素濃度進一步持續(xù)升高，淀粉酶活性又呈現(xiàn)上升的趨勢。這在一定程度上說明，高氮脅迫下，碳代謝強度加大，淀粉酶活性升高。蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，包括細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶3類。糖類不僅作為一種能源物質(zhì)，同時也是重要的信號分子。越來越多的研究表明，植物體內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶能夠?qū)μ妓衔锏拇x和分配進行調(diào)控，從而改變植物的發(fā)育模式[16]。由圖3（b）可知，不同氮素處理20d后，隨著施氮量的增加，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性逐漸上升，在氮含量為0.2%、0.3%，轉(zhuǎn)化酶活性無顯著差異，但整體來看，3個處理組與對照組相比，其轉(zhuǎn)化酶活性顯著提高。

蔗糖合成酶可逆的將蔗糖分解為鳥苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖;而蔗糖磷酸合成酶可催化UDPG與果糖6-磷酸結(jié)合形成磷酸蔗糖。蔗糖作為植物代謝，發(fā)育和生長中的重要物質(zhì)，不僅能在植株生長中提供能量和碳骨架，而且能夠提高植株的抗逆性[16]。蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶都參與蔗糖的合成，其活性的高低直接體現(xiàn)了植物體蔗糖合成的能力強弱。由圖3（c）和3（d）可知，隨著施氮量的提高，蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶的活性隨之上升;當(dāng)?shù)吭?.2%、0.3%時，2種酶活性沒有顯著性差異，但3個處理組與對照組之間，2種酶活性與未施氮的處理組之間具有極顯著差異。

2.4 不同施氮量對氮代謝相關(guān)酶活性的影響 GS是處于氮代謝中間的關(guān)鍵酶，主要催化NH4+離子與氨基酸合成谷氨酰胺，進而參與光呼吸氨、還原氨、循環(huán)氨的再同化等代謝過程，GS活性的增強，使植株對氮素的吸收能力增強，當(dāng)?shù)睾窟^高時，植株自身受到脅迫作用大，氮素轉(zhuǎn)化率隨之降低，活性下降。從圖4（a）可以看出，隨著施氮量的提高，GS活性隨之上升，但當(dāng)施氮量達到0.4%時，GS活性反而降低。GOGAT（GOGAT）主要催化谷氨酰胺與a-酮戊二酸形成谷氨酸。在高等植物體中銨離子的同化離不開GOGAT的協(xié)同催化，其與GS組成的GS/GOGAT循環(huán)系統(tǒng)，在植物固定氮素過程中起著關(guān)鍵性作用[16]。從圖4（b）可以看出，隨著施氮量的提高，GOGAT的活性隨之顯著性上升。在后3組氮素處理中GOGAT的活性沒有顯著性差異。結(jié)果表明，在高氮脅迫下，植物體吸收氮素后，其氮素同化作用加強。植物體內(nèi)的氮循環(huán)中常由GS和GOGAT協(xié)同作用，組成GS/GOGAT循環(huán)，將NH4+離子轉(zhuǎn)化為氨基酸，該途徑為高等植物NH4+離子同化的主要途徑。同時，GDH可催化a-酮戊二酸與氨生成谷氨酸，該催化過程為可逆反應(yīng)。GDH有雙重功能，當(dāng)外部環(huán)境無機氮源水平較高的時候，GDH行使銨同化作用;當(dāng)植物缺少有機碳源時，GDH主要促進谷氨酸分解，并為三羧酸循環(huán)提供碳骨架。因此，GDH一定程度上可以促進碳氮代謝的平衡，對維持植物體內(nèi)碳氮平衡起著關(guān)鍵作用[16]。由圖4（d）可知，隨著施氮量的增加，GDH的活性隨之上升，有可能是氮素水平較高，需要高的GDH活性行使銨同化功能。

植物主要從土壤中吸收銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，其中硝酸鹽是高等植物的主要氮來源。NR將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽進入葉綠體或質(zhì)體中，最終被降解為銨。NR是植物氮同化的關(guān)鍵酶，在初級氮同化中的控制中起著關(guān)鍵性的作用[16]。由圖4（c）可知，隨著施氮量的增加，含氮量在0.2%、0.3%時，NR活性顯著性降低，當(dāng)施氮量達到0.4%時，NR活性卻反而上升。

2.5 可溶性糖含量與煙堿含量的相關(guān)性分析 對不同氮素水平與煙堿含量和可溶性糖含量進行相關(guān)性分析可知（圖5），煙堿含量與氮素水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，煙堿作為氮代謝途徑中的關(guān)鍵產(chǎn)物，隨著施氮量的增加，煙堿含量隨之降低。而氮素水平與可溶性糖含量相關(guān)較低。說明在高氮脅迫下，高濃度的氮素濃度，使氮代謝和碳代謝過程都受到一定程度的抑制，但從氮代謝和碳代謝相關(guān)酶活性的變化中可以看出，氮代謝初級酶NR活力隨著氮素濃度的升高而降低，雖然在氮素同化的相關(guān)酶活性GDH、GS、谷氨酸合成酶活性升高，但氮代謝初級酶活力限制了氮同化的能力，導(dǎo)致氮代謝能力降低。而碳代謝相關(guān)酶蔗糖合成酶、淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶活力隨氮素濃度的提高而隨之上升。該結(jié)果說明，在6葉齡煙草植株中，施用高濃度的氮素濃度會將碳代謝能力提高，氮代謝能力降低，葉片顏色濃綠，植株矮小，碳氮代謝之間的平衡被破壞，使得煙草植株生長達不到最佳狀態(tài)。植物對NH4+的濃度忍耐性較低，高濃度NH4+影響根系和幼苗的生長本試驗中，本試驗中利用CO（NH2）2調(diào)控氮素水平，可能也是得到煙堿含量與氮素水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)結(jié)論的原因之一。

3 討論

煙草的生長與施氮量具有非常密切的關(guān)系，碳代謝與氮代謝作為植物體內(nèi)的基本的代謝，是植物體積累養(yǎng)分的過程。同時氮素是植物的生命元素，不同水平的施氮量對植株的生長，碳氮代謝之間的平衡與協(xié)調(diào)，植株發(fā)育，與物質(zhì)的積累具有重要影響。煙葉作為煙草植株中主要收獲的產(chǎn)品，其品質(zhì)的高低也與施肥量有關(guān)。

植物根系對NH4+的吸收為被動吸收，但植物根系吸收NH4+時在細(xì)胞膜外脫H+或分泌H+，因而造成土壤酸化，危害植物的生長發(fā)育。本試驗結(jié)果表明，在高氮水平下，繼續(xù)進一步加大施氮量，對植株的生理生長具有迫害作用，植株葉片顏色逐漸加深，葉片數(shù)減少，葉片發(fā)黃甚至萎蔫致死，當(dāng)?shù)貪舛冗_到0.4%時，植株生長受到的脅迫更大，幾乎致死。同時，隨著氮素濃度的增加，NR活性降低。有研究指出，NR在一定程度上代表植株的氮代謝強度，而煙堿作為氮代謝的產(chǎn)物，隨著含氮量增加，煙堿含量隨之降低。這在一定程度上說明，過高的含氮量對煙草氮代謝具有一定的脅迫作用，氮代謝減慢，植株生長受到抑制。

碳代謝是煙草植株生長和品質(zhì)形成的基本代謝之一，對煙草植株中重要化合物的組分，含量和比例具有重要影響[17]。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶是碳代謝中非常重要的酶，其活性可作為衡量碳代謝強度的重要指標(biāo)[18]。本試驗中，隨著氮素濃度的升高，蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶活性升高。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶在蔗糖代謝和積累中起著重要作用，蔗糖磷酸合成酶主要介導(dǎo)的反應(yīng)為催化葉片中蔗糖的形成[19]，而蔗糖合成酶介導(dǎo)蔗糖的合成與分解，轉(zhuǎn)化酶作為一種水解酶，可催化蔗糖形成單糖[20]。在高氮脅迫下，碳代謝強度增強。氮肥的供應(yīng)量與碳代謝相關(guān)酶活性密切相關(guān)，過高或過低的施氮量對植株的生長均產(chǎn)生不利影響[21]。

氮代謝在煙草生長過程中起著重要作用，包括有機物的合成和轉(zhuǎn)化[22]，煙草的氮代謝過程屬于多種酶參與的復(fù)雜反應(yīng)，這些酶在氮代謝過程起著不可或缺的作用。NR、谷氨酸合成酶、GS、GDH等都是氮代謝中關(guān)鍵酶，本次試驗中，NR隨著氮素濃度的上升活性隨之降低，而谷氨酸合成酶、GS、GDH隨著氮素濃度的升高，其活性隨之升高。NR作為硝酸同化過程中第1個關(guān)鍵酶，對植物的生長，呼吸及光合作用有著極其大的影響，NR活性在一定程度上可反映煙草的氮代謝水平[23]。有研究表明，烤煙的NR活性和GS活性均隨著生育進程的推進而增加，60d達到最大值然后下降。本試驗中，高氮濃度處理下，隨著氮素濃度的升高，NR活性的降低，表明高氮脅迫下，煙草植株的生長受到脅迫，初始氮代謝強度降低。煙草植株的氨同化過程是通過GS/GOGAT循環(huán)[2]進行的，隨著氮素濃度的提高，兩種酶活性升高，說明在高氮脅迫下，植株的氮同化的效率提高。而對于GDH來講，隨著在GDH的催化下，谷氨酸脫氨生成2-酮戊二酸。2-酮戊二酸為植物體內(nèi)主要的氨同化途徑GS/GOGA循環(huán)提供底物，為氨同化提供碳骨架，同時它還是三羧酸循環(huán)過程中重要的一種中間物，和碳代謝的下游一種非常重要的有機酸，GDH是連接C、N代謝的關(guān)鍵點[24]。在本試驗中，隨著氮素濃度的提高，GDH的活性隨之上升。高氮情況下，GDH主要行使碳代謝相關(guān)酶功能還是氮代謝相關(guān)酶功能沒有準(zhǔn)確的研究結(jié)論。但有研究表明，GDH只有在氨濃度高時才起到同化作用，GDH在解除氨毒過程中起到主要作用[25]。同時，GDH作為碳氮代謝中的關(guān)鍵酶，起到的谷氨酸脫氨作用能夠使得氨進入GS/GOGA循環(huán)，對整個循環(huán)過程起到輔助作用。

在高氮水平下，含碳化合物可溶性糖含量，含氮化合物煙堿的含量隨著施氮量的增加，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但是整體呈現(xiàn)下降的趨勢，表明高氮水平抑制煙株的生長，減少了糖類的積累。煙堿的主要形成部位在根部，脅迫作用下，對植物根部的損害作用加大，導(dǎo)致煙堿的合成受阻，煙堿含量降低。從整體來看，碳氮代謝都因施用過量的氮肥而受到影響，在此過程中造成碳代謝過程提前，氮代謝過程延緩，碳氮代謝平衡受到破壞，不利于植株生長。

4 結(jié)論

通過研究4個不同氮濃度下，碳氮代謝中關(guān)鍵酶活性及物質(zhì)積累，可以得出以下結(jié)論：（1）在高氮水平下，隨著施氮量的增加，對植株的脅迫作用加大，主要表現(xiàn)在：植株矮小，葉片顏色加深，生長緩慢，氮素濃度在0.4%植株葉片邊緣發(fā)黃甚至凋零;（2）隨著施氮量的增加，碳代謝相關(guān)酶，蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶活性增加，說明在高氮處理下碳代謝加強;（3）隨著施氮量的增加，氮代謝中主要酶NR活性隨著施氮量的增加，整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但酶活性整體呈下降的趨勢，表明在高氮抑制氮代謝，抑制植株的生長;（4）高濃度的氮含量對植物煙堿的形成有抑制作用，影響根部合成煙堿。同時，高濃度的氮含量使得煙草植株可溶性糖含量降低，糖類作為植物中直接供能物質(zhì)，其含量的降低直接反映了高氮處理下植株矮小，生長受阻的表型。由此可知，適宜的氮含量對煙草植株生長有著極其重要的影響。

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（責(zé)編：張宏民）