產(chǎn)漆酶真菌的篩選及發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

王雪 劉太林 楊焜梅 王志成 湛瑩 薛兆淞 李永佳

摘 要：從4種白腐真菌（金針菇Flammulina velutipes、秀珍菇Pleurotus geesteranus、雞腿菇Coprinus comatus、黑木耳Auriculariaheimuer）中通過愈創(chuàng)木酚與漆酶形成顯色圈時間、大小、顏色深淺的方式篩選出產(chǎn)漆酶能力最強的菌株為金針菇。研究了碳源、氮源、各種理化因素等培養(yǎng)條件對漆酶分泌的影響，并通過正交實驗設(shè)計優(yōu)化產(chǎn)酶條件。單因素結(jié)果表明：pH為5時，漆酶分泌最高，酶活分別為235U/mL;培養(yǎng)溫度28°C時，漆酶分泌最高，酶活分別為269U/mL;培養(yǎng)時間7d，漆酶分泌最高，酶活分別為311U/mL;蔗糖作碳源、豆粕作氮源，且碳氮總量不變時，碳氮比為10∶1時漆酶分泌最高，酶活為309U/mL。正交試驗表明：蔗糖10g/L，豆粕1g/L，在250mL的三角瓶中，pH為6，溫度28°C時，金針菇在第5天達產(chǎn)酶高峰，峰值酶活為330U/mL。

關(guān)鍵詞：漆酶;篩選;金針菇;培養(yǎng)條件

中圖分類號? TQ92文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）23-0031-04

Screening of Laccase-producing Fungi and Optimization of Fermentation Conditions for Fermentation

Wang Xue et al.

（Food Engineering College，Tianshi College，Tianjin 301700，China）

Abstract：From four species of white rot fungi，F(xiàn)lammulina velutipes，Pleurotus geesteranus，Coprinus comatus，Auriculariaiaheimuer，the strains with the highest laccase production capacity were selected as Flammulina velutipes by comparing the formation cycle time，size and color of guaiacol and laccase.The effects of culture conditions such as carbon source，nitrogen source and various physical and chemical factors on laccase secretion were studied，and the conditions for enzyme production were optimized by orthogonal experimental design. The single factor results showed that the laccase secretion was the highest at pH 5 and the enzyme activity was 235 U/mL. The laccase secretionwas the highest at 28°C，and the enzyme activity was 269 U/mL. The laccase secretion was reached at 7 days. The peak activity was 311 U/mL;sucrose was used as carbon source and soybean meal was used as nitrogen source. When the total carbon and nitrogen specific gravity was unchanged，the laccase secretion was the highest at 10：1，and the enzyme activity was 309 U/mL. Orthogonal test showed that：sucrose 10g/L，soybean meal 1g/L，in a 250mL volumetric flask，pH is 6，the temperature of 28 °C，F(xiàn)lammulina velutipes reached the peak of enzyme production on the 5th，the peak enzyme activity was 330U/mL.

Key words：Laccase;Screening;Flammulina velutipes;Culture conditions

漆酶最早是在漆樹的液汁中發(fā)現(xiàn)的，在分類中屬于多酚氧化酶，蛋白分子中含銅元素，屬于藍銅家族氧化酶。與植物Vc氧化酶、哺乳動物血漿銅藍蛋白、膽紅素氧化酶等同屬1種氧化酶家族[1-3]。漆酶能催化木質(zhì)素和含酚類化合物的降解、高分子化合物的合成。漆酶特有的銅離子能夠在氧化還原反應(yīng)中傳遞電子，使漆酶具有了較強的氧化還原能力。漆酶能與木質(zhì)素、胺類化合物、芳香化合物等底物發(fā)生作用，且大多數(shù)反應(yīng)的唯一產(chǎn)物為水[4-6]，所以在食品工業(yè)、環(huán)保工業(yè)、造紙工業(yè)等領(lǐng)域都需要大量低成本高活力的漆酶[7]。漆酶普遍存在于白腐真菌中，是白腐真菌木素降解酶系的重要組成部分之一[8]。在自然界中大部分白腐真菌的產(chǎn)漆酶能力都較低且根據(jù)試驗得知不同培養(yǎng)基的不同底物濃度、溫度、pH、發(fā)酵時間產(chǎn)漆酶能力也有很大的差異[9]。

我們對常見的白腐真菌（金針菇、秀珍菇、雞腿菇、黑木耳）進行了漆酶活力的初步測定，篩選出一株白腐菌漆酶高產(chǎn)菌株，并對其產(chǎn)生漆酶的條件進行了初步研究，確定了最優(yōu)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的條件，以期為企業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 菌種：金針菇、秀珍菇、雞腿菇、黑木耳，購于濱海利農(nóng)菌業(yè)，經(jīng)天津天獅學院生物工程實驗中心擴大培養(yǎng)用于實驗。

試劑：愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）購于國藥集團化學試劑有限公司;蔗糖、葡萄糖、瓊脂粉購于天津市風船化學試劑科技有限公司;土豆、豆粕購于沃爾瑪超市。

儀器：賽多利斯天平BSA124S，德國產(chǎn);恒溫培養(yǎng)搖床HNY-200B，天津歐諾產(chǎn);紫外可見分光光度計UV1000，上海天美產(chǎn);臺式高速離心機TG16K-II，長沙東旺產(chǎn);高壓蒸汽滅菌鍋MJ-78Q，上海施都凱產(chǎn);超凈工作臺SW-CJ-2G，蘇州凈化產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基的制備 將1L去離子水倒入電磁爐中，加入200g土豆，大火煮沸后溫火煮20min，8層紗布過濾，用蒸餾水定容至1L。加入葡萄糖20g，pH調(diào)到6.0作為基本培養(yǎng)基。根據(jù)試驗設(shè)計的需要，在基本培養(yǎng)基中添加不同蔗糖、豆粕作為碳源和氮源。

1.2.2 菌種培養(yǎng) 將4種斜面菌種接種到綜合PDA平板上25°C活化培養(yǎng)14d。在超凈臺下，用打孔器取長勢一致的菌絲，接種于液體培養(yǎng)基中，于25°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)8d，收集菌絲體懸液作為液體菌種。接種時，在超凈臺下用移液槍精確吸取2mL加入到不同試驗組，在25°C、180r/min搖床中培養(yǎng)。

1.2.3 漆酶活力測定 超凈工作臺中取待測樣發(fā)酵液500μL，臺式離心機中4000r/min離心5min，上清液即為粗酶液。酶活性測定體系為3mL，其中0.1mol/L，pH4.5乙酸-乙酸鈉緩沖液2.7mL，適當稀釋的粗酶液0.1mL和0.5mol/LABTS溶液0.2mL。25°C水浴鍋中反應(yīng)3min后，迅速轉(zhuǎn)入冰水以終止反應(yīng)。用紫外可見分光光度計測定420nm處反應(yīng)吸光值的變化。定義1min氧化1μmolABTS所需的酶量為1個酶活力單位（U/L）。每個樣品3個重復，以煮沸滅活粗酶液為對照。漆酶活性計算公式[10-11]如下：

[? OD×V1? t×V2×ε420]×106×稀釋倍數(shù)

式中：ε420（ABTS）=3.6X104L/（mol·cm）;△t=1min;△OD為1min內(nèi)吸光度的變化值;V1為酶反應(yīng)中反應(yīng)液的總體積，3mL;V2為酶反應(yīng)中酶液的體積，0.1mL。

1.2.4 產(chǎn)漆酶菌株的篩選 將活化的菌株接種到以愈創(chuàng)木酚為底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，定時觀察菌落生長和菌落周圍顏色深淺變化情況。選出顏色適中且沒有明顯抑制作用的顯色圈的菌株。每天定時觀察菌落形態(tài)的同時，測定變色圈的出現(xiàn)時間、測量變色圈直徑和記錄變色圈顏色深淺，通過上述方法比較得出不同菌種的產(chǎn)漆酶能力[12-13]。

1.2.5 單因素試驗 （1）pH在基本培養(yǎng)基中加入適量的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液，將pH分別調(diào)試至3、5、6、7、9。溫度為常溫25°C，C/N為1∶5，每個水平做3次，取平均值。培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。（2）溫度對菌種產(chǎn)漆酶的影響：改變恒溫培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定，使其為20、25、28、30、35°C，pH調(diào)試至6，C/N為1∶5，每個水平做3次，取平均值。培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。（3）培養(yǎng)時間：設(shè)定培養(yǎng)時間為3、5、7、9、11d，pH調(diào)試至6，保持室溫25°C，C/N為1∶5，每個水平做3次，取平均值。培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。（4）培養(yǎng)基中碳氮比：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中保證溫度為常溫25°C，pH調(diào)試至6，碳源氮源總量不變的情況下，改變C/N（蔗糖/豆粕）比例（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），每個水平做3次，取平均值。培養(yǎng)后測定并記錄結(jié)果。

1.2.6 正交試驗 根據(jù)1.2.4單因素試驗研究中的實驗結(jié)果，從每種單因素中各自選取3個水平進行L9（34）正交實驗設(shè)計。選出最優(yōu)的條件后，根據(jù)最優(yōu)條件做3次重復試驗，驗證結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種的產(chǎn)漆酶能力 在常溫條件下用1.2.4中的方法對4種菌種進行培養(yǎng)，首先選擇無明顯抑制作用和出現(xiàn)變色圈時間較短的培養(yǎng)基，然后在其中選擇變色圈顏色適中、直徑較大的菌種。進行1.2.5漆酶活力測定。結(jié)果見表1，由表1可知，在相同條件下，金針菇產(chǎn)漆酶活力最強，其余菌株較低，故選用金針菇作為后續(xù)實驗的試驗菌種。

2.2 pH對產(chǎn)漆酶能力的影響 由圖1可見，隨著pH的增大，金針菇菌種發(fā)酵產(chǎn)漆酶的酶活力先升高后降低。在pH=5時，漆酶活力最高（235U/mL）、漆酶的產(chǎn)量最多;pH繼續(xù)增加可能會對金針菇的生長產(chǎn)生部分抑制作用，分泌的漆酶產(chǎn)量下降。由此可見，在培養(yǎng)的過程中，過高過低的pH既不利于發(fā)酵產(chǎn)漆酶，又不利于金針菇的生長。

2.3 溫度對產(chǎn)漆酶能力的影響 由圖2可見，隨著溫度的改變，針菇菌種發(fā)酵產(chǎn)漆酶的酶活力先升高后降低，但總體影響并不明顯，28°C時出現(xiàn)峰值。生產(chǎn)漆酶時，可以考慮不用調(diào)整溫度，保持室溫即可，但不宜偏高或偏低，因為溫度較高或較低都會抑制金針菇產(chǎn)漆酶的活力。

2.4 培養(yǎng)時間對菌種產(chǎn)漆酶的影響 由圖3可見，隨著時間的延長，金針菇菌種發(fā)酵產(chǎn)漆酶的酶活力先升高后降低，在時間為7d時活力最高（311U/ml）、漆酶的產(chǎn)量最多。若繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，漆酶會被降解導致酶活力降低，所以在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)時間不宜過長。

2.5 培養(yǎng)基中碳氮比的不同對漆酶的影響 由圖4可見，在碳源氮源總量不變的情況下隨著碳源的增加，其菌種產(chǎn)漆酶的活力逐漸提高。在碳氮比為10∶1到20∶1范圍內(nèi)金針菇產(chǎn)漆酶活力最高。

2.6 正交實驗結(jié)果及分析 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，從這3種單因素中各自選取3個水平進行L9（34）正交實驗設(shè)計（表2）。正交實驗結(jié)果見表3，由表3可知，影響金針菇發(fā)酵產(chǎn)漆酶量多少的主要因素是培養(yǎng)基的碳氮比，其次是發(fā)酵時間，然后是發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，最后是發(fā)酵溫度。溫度對發(fā)酵過程中產(chǎn)漆酶的影響比較小，所以在發(fā)酵過程中保持室溫就可以。把控好發(fā)酵時間以免培養(yǎng)時間過長導致漆酶被降解，產(chǎn)漆酶量降低。

2.7 結(jié)果驗證及分析 按照2.5中最優(yōu)的實驗方案，進行3次重復試驗，測得漆酶活力的數(shù)值為330U/mL，相對標準偏差小于5%，但是實驗數(shù)值高于正交數(shù)值，證明此培養(yǎng)基條件為最適培養(yǎng)條件。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)實驗最終確定金針菇發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的最優(yōu)條件是碳氮比為10∶1，pH為6，發(fā)酵溫度為28℃，培養(yǎng)時間為5d，在實際生產(chǎn)中需要改變的因素比較容易，改動范圍較窄，因此有利于實施，故此方案可作為高產(chǎn)漆酶的方案。

（責編：張 麗）