鹽堿土壤中微生物菌株的分離、篩選與功能評價

武芳 李勇 路兆軍

摘 要：通過對鹽堿土壤中微生物菌株的分離、篩選和功能評價，結果表明，菌株DY23具有較好的耐鹽堿能力，在培養(yǎng)基的NaCl濃度達到20%且pH值為12.0的條件下仍可生長;對棉枯萎病、黃瓜枯萎病、小麥紋枯病和煙草赤星病均具有生防作用;具有較好的溶磷能力;可分泌生長素IAA，對小白菜有較好的促生作用;經(jīng)16SrRNA序列的測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫的比對，顯示其為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）。

關鍵詞：鹽堿;分離;篩選;功能評價;阿氏芽孢桿菌

中圖分類號 S156.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）23-0024-05

Isolation，Screening and Functional Evaluation of Microbial Strains in Saline Alkali Soil

Wu Fang1 et al.

（1Yantai Diyuan Biotechnology Co.，Ltd.，Yantai 264003，China）

Abstract：Through isolation，screening and functional evaluation of microbial strains in saline-alkali soil，it was found that strain DY23 had good salt-alkali tolerance，and could grow when NaCl concentration reached 20% and pH value was 12.0;it had biocontrol effects on Cotton Fusarium wilt，Cucumber Fusarium wilt，Wheat Sheath Blight and tobacco brown spot;it had good phosphorus-soluble ability;It secretes auxin IAA;It also has a good growth promoting effect on Chinese cabbage. By comparing the 16S rRNA sequence with NCBI database，it was shown that it was Bacillus aryabhattai.

Key words：Saline-alkali;Isolation;Screen;Functional evaluation;Bacillus aryabhattai

近年來，隨著土地鹽堿化的日益加劇，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的影響越來越嚴重。從世界范圍來看，約有20%的耕地和接近50%的灌溉農(nóng)田產(chǎn)量嚴重受到高濃度鹽堿土壤的影響。在中國，約有670萬hm2的次生鹽漬化農(nóng)田，占耕地總面積的10%。如何減輕鹽堿土壤對農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的影響、更好地利用鹽堿地，提高農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益，是現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)所關注的重大問題之一[1]。在國內外鹽堿地改良研究領域，先后提出了“種稻改堿”[2]農(nóng)業(yè)改良措施，“灌水洗鹽”[3]工程改良措施，以及利用石膏、氯化鈣、工業(yè)廢酸、燃煤煙氣脫硫物等化學改良措施。這些措施見效快，取得了顯著的成果，但與此同時，也存在改良成本高，資源耗費大，且產(chǎn)生了養(yǎng)分流失、污染下游、改良效果不穩(wěn)定、容易返鹽等問題。

隨著對鹽堿土壤的不斷研究，并結合環(huán)保改良理念，人們開始從恢復生態(tài)的角度將鹽堿地的改良和利用結合起來，即“寓改良到利用中，改良與利用并行”，發(fā)現(xiàn)以生物利用為核心的生態(tài)恢復技術是未來鹽堿地改良修復的突破口。目前，生物改良包括種植耐鹽堿植物、使用微生物菌肥等。而開發(fā)高效的微生物菌肥制劑，首先要獲得在高鹽條件下能夠促進植物生長的微生物菌株。本研究通過針對性的采取樣品，并經(jīng)過分離、篩選及功能評價等措施，得到了1株在高鹽堿環(huán)境下具有促生和防病潛力的菌株，經(jīng)鑒定為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），為加速以生物利用為核心的生態(tài)修復技術的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品? 本研究的樣品共2份，1份于2009年10月采自四川瀘州白酒生產(chǎn)廠的中層窯泥，編號為1號;另1份于2009年8月采自天津靜海地區(qū)玉米地的表層土壤，編號為2號。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 Gibbons改良培養(yǎng)基[4] 干酪素5.0g，檸檬酸鈉3.0g，酵母浸粉10.0g，KCl2.0g，蛋白胨5.0g，MgSO4·7H2O2.0g，NaCl100g，pH值9.0[5]。固體培養(yǎng)基需每1000mL加20g瓊脂。

1.1.2.2? 蒙金娜有機培養(yǎng)基[6]? Glucose 10g，（NH4）2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03g，SO4Mn 4H2O0.03g，Lecithin（卵磷脂）0.2g，Yeast extract paste 0.4g，Agar 20g，蒸餾水補足至1000mL，pH7.0～7.5。

1.1.2.3? PKO無機培養(yǎng)基[6]? Ca3（PO4）23.0g，Sucrose 10g，（NH4）2SO4 0.5g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.3g，F(xiàn)eSO4 0.002g，MnSO4 0.004g，Yeast extract paste 0.5g，Agar 15g，蒸餾水補足至1000mL，pH 6.8～7.2。

1.1.2.4? 亞歷山大羅夫培養(yǎng)基[7]? 蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4.·7H2O 0.5g，F(xiàn)eCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，土壤礦物1g，瓊脂20g，pH 7.0～7.5。

1.1.2.5? CCM液體培養(yǎng)基[8]? 甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，CaCl2·2H2O 0.06g，NaCl 0.1g，NaMoO4·2H2O 2.5mg，酵母粉0.1g，F(xiàn)e-EDTA 4mL（1.64%），NH4NO3 1g，色氨酸0.1g，pH值7.0。

1.1.2.6? 保存培養(yǎng)基? 牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂18g，加蒸餾水配成1000mL，pH值調至7.2～7.4，121℃滅菌20min倒斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 供試植物和土壤? 試驗植物為小白菜，盆栽土壤選取山東陵縣鹽堿地未改良土。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化? 首先，將土壤樣品進行風干處理，而后分別稱取10g，磨碎后加入到裝有90mL0.9%的無菌生理鹽水和少量玻璃珠的三角瓶中，200r振蕩20min后，進行梯度稀釋。取0.1mL經(jīng)適當稀釋后梯度的樣品涂布于Gibbons改良培養(yǎng)基平板上。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d。待長出單菌落后，挑取單一菌落進行劃線培養(yǎng)，并通過反復平板劃線得到純菌株。然后將純菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，于30℃下恒溫培養(yǎng)4d后，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐鹽堿微生物菌株的篩選及鹽堿耐受力的測定 通過不斷分別提高Gibbons改良培養(yǎng)基的鹽度和堿度，來進行耐鹽堿微生物菌株的篩選。首先使Gibbons改良培養(yǎng)基pH值保持為9.0，逐次將培養(yǎng)基的鹽度提高2%，使NaCl濃度分別為10%、12%、14%、16%、18%和20%;然后再將Gibbons改良培養(yǎng)基鹽度的NaCl濃度保持10%不變，每次將培養(yǎng)基的pH值提高1個單位，即pH值分別為8、9、10、11和12。將斜面培養(yǎng)基上保存的菌株接種到上述平板上，置于30℃環(huán)境下培養(yǎng)8d，以菌株是否可以長出來作為評判菌株是否耐鹽堿的標準，從而篩選出具有耐鹽堿能力的菌株。

1.2.3 耐鹽堿微生物菌株的生防作用評價 采用平板對峙法，評價部分功能菌株對棉花枯萎病、黃瓜枯萎病、小麥紋枯病、煙草赤星病等4種病原菌的拮抗能力。將篩選得到的6株耐鹽堿能力較好的菌株與4種病原菌在PDA平板上作對峙培養(yǎng)，平板中央接種新鮮的病原菌，在距離平板邊緣1cm處用接種環(huán)涂直徑為0.5cm的細菌菌斑，28℃恒溫培養(yǎng)3～5d后，觀察各個菌株對病原菌拮抗作用的有無。

1.2.4 耐鹽堿微生物菌株溶磷、解鉀能力評價 利用菌株自身產(chǎn)生有機酸，經(jīng)滲透擴散將其周圍的有機或無機磷溶解從而形成1個透明的環(huán)。采用有機磷（蛋黃卵磷脂）和無機磷（Ca3（PO4）2）固體培養(yǎng)基溶磷圈法進行功能菌株溶磷能力的測定，每個供試菌株分別點接于蒙金娜有機磷和PKO無機磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，每培養(yǎng)皿3個接菌點，每菌3個重復，置生化培養(yǎng)箱28℃下恒溫培養(yǎng)，每天測量菌落直徑和溶磷透明圈直徑，至其無明顯變化止。每個菌種分別點接于亞歷山大羅夫培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿3個接菌點，每株菌3個重復，置生化培養(yǎng)箱28℃下恒溫培養(yǎng)，每天測量菌落直徑和解鉀透明圈直徑，至其無明顯變化。

1.2.5 耐鹽堿微生物菌株促生能力評價 植物生長激素（IAA）對作物的生長、產(chǎn)量及品質、均有較大的影響。采用Salkowski比色法[9-11]測定細菌分泌植物生長激素（IAA），將供試菌株接種CCM液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中需加入色氨酸）的三角瓶中，每瓶盛有50mL培養(yǎng)基，每菌株重復3次，置于28℃搖床，180r震蕩培養(yǎng)4d。取100μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加100μLSalkowski比色液（50mL 35%HClO4和1mL0.5M FeCl3混合）。對照只在比色液中加入50μL50mg/L的IAA。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA。

1.2.6 盆栽效果評價試驗

1.2.6.1? 耐鹽堿微生物菌株菌液的制備? 菌液的制備方法為于-70℃冰箱中取出原始菌株，在LB平板上劃線，28℃下培養(yǎng)24h，待長出單菌落，挑取其接入含有5mL LB培養(yǎng)液的試管中，28℃，200r培養(yǎng)24h，制成種子液;以1%的接種量將種子液接種于裝有500mL LB培養(yǎng)液的1L規(guī)格的大三角瓶里，28℃，200r培養(yǎng)22～24h，以得到濃度為1～10×108cfu/mL的菌液。

1.2.6.2? 盆栽效果評價實驗? 選用30cm栽培盆，生長速度快的小白菜作為供試作物，土壤選取山東陵縣鹽堿地未改良土，共設置8個處理，分別為：（1）清水對照，（2）培養(yǎng)基對照，（3）DY07菌液，（4）DY08菌液，（5）DY12菌液，（6）DY19菌液，（7）DY23菌液，（8）DY24菌液。每個處理24棵苗，每盆1棵苗。待小白菜長出2片真葉時，濃度為1×108CFU/mL的菌液緩慢灌入小白菜苗根圍，每株20mL，隨后置于溫室中培養(yǎng)，28℃，70%相對濕度以上，16/8h光周期，觀察小白菜生長情況。生長15d后對小白菜的株高、根長和鮮重進行測量，求出平均值。

1.2.7 菌株鑒定 鑒定方法為16S rRNA基因片段序列測序。采用上海賽百盛基因技術有限公司的基因組DNA快速提取試劑盒，提取細菌的基因組DNA，以提取的DNA產(chǎn)物為模板，用細菌16S rDNA擴增通用引物U8-27、L1494-1514從基因組DNA中擴增出16S rDNA基因片段。

引物：U8-27（F）5'-AAGTTTGA TC（AC）TGGCT-AG-3';

L1494-1514（R）5'-CTACGG（AG）TACCTTGTTAC-AC-3'

反應體系：10×PCR Buffer ………………… 2.5μL

Mg2+ …………………………… 3.75μL

dNTP ……………………………2μL

引物P1/P2 ………………………0.6μL

模板DNA …………………………1μL

rTaq 酶 ………………………… 0.5μL

加超純水至 ………………………25μL

反應參數(shù)：[94°C …… 5min94°C …… 1min56°C …… 1min72°C …… 2min72°C …… 10min12°C …… forever30 cycles]

PCR產(chǎn)物用1%（w/v）的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電壓120V，15min，EB染色20min，用凝膠回收試劑盒回收所需條帶。將目標片段連接至載體pMD19-T，然后轉入大腸桿菌（Escherichia coli）Top-10感受態(tài)細胞中，挑取單克隆，搖菌，測序。獲得的16S rDNA序列在Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）進行比對，獲得鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 耐鹽微生物菌株的鹽堿耐受力 以四川瀘州白酒生產(chǎn)廠的中層窯泥樣品樣本和天津靜海地區(qū)玉米地表層土壤樣本為來源，在Gibbons改良培養(yǎng)基上分離得出50株菌株，并通過鹽堿耐受力篩選得到6株具有耐鹽堿的菌株，其中菌株DY23的耐鹽能力最好，在NaCl濃度為20%的培養(yǎng)基上即可長出;而菌株DY24的耐堿能力最強，在pH值為12.0的培養(yǎng)基上即可長出（如表1和表2）。同時，提高Gibbons改良培養(yǎng)基的鹽（NaCl）濃度和堿濃度（pH值），以菌株是否長出來比較各菌株的同時耐鹽、堿能力。結果顯示，只有1株同時既耐鹽又耐堿的菌株DY23，當培養(yǎng)基的NaCl濃度達到20%且pH值為12.0的條件下仍可生長（如表3）。

2.2 耐鹽微生物菌株的生防作用 通過平板對峙法，發(fā)現(xiàn)篩選出的耐鹽堿菌株表現(xiàn)出了不同程度的拮抗作用，其中菌株DY07對棉枯萎病、黃瓜枯萎病和煙草赤星病有拮抗作用，菌株DY08和DY19對棉枯萎病菌和煙草赤星病有拮抗作用，菌株DY12只對棉枯萎病有拮抗作用，而菌株DY23和菌株DY24對4種病原菌均表現(xiàn)出拮抗作用（如表4）。

2.3 耐鹽堿微生物菌株溶磷、解鉀能力 通過在蒙金娜有機磷和PKO無機磷培養(yǎng)基培養(yǎng)上的測定，發(fā)現(xiàn)菌株DY07、DY08、DY19、DY23和DY24均有不同程度的溶磷能力，其中菌株DY08和DY23的溶磷能力最強;通過在亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上的檢測，發(fā)現(xiàn)只有菌株DY12有解鉀能力（如表5）。

2.4 耐鹽堿微生物菌株促生能力 通過Salkowski比色法測定，發(fā)現(xiàn)菌株DY19、DY23和DY24可分泌IAA，其中菌株DY23分泌IAA的能力更強（如表6）。

2.5 盆栽效果 通過盆栽效果評價試驗，發(fā)現(xiàn)施用菌劑的小白菜在株高、根長和鮮重方面指標都明顯優(yōu)于2個對照組，且培養(yǎng)基對照組和清水對照有不出苗和死苗的現(xiàn)象，其中DY23菌劑處理組的株高、根長和鮮重都明顯優(yōu)于其他處理組（如表7）

2.6 菌株測序結果 通過以上試驗發(fā)現(xiàn)，菌株DY23有較好的耐鹽堿能力，當培養(yǎng)基的NaCl濃度達到20%且pH值為12.0的條件下仍可生長;對棉枯萎病、黃瓜枯萎病、小麥紋枯病和煙草赤星病均有生防作用;具有較好的溶磷能力;可分泌生長素IAA，并對小白菜有較好的促生作用，故該菌在鹽堿環(huán)境中可能有較好的促生和生防作用，經(jīng)16S rRNA序列的測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫的比對，顯示其為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），相似度為98.9%（如表8）。

3 結論與討論

科學家們根據(jù)微生物菌株的耐鹽程度，提出了不同的耐鹽性分類系統(tǒng)[12-17]，其中最常用的為Larsen等（1987）和Vreeland（1987）提出的分類系統(tǒng)。根據(jù)微生物菌株對NaCl的敏感程度，將其分為以下4大類：（1）非嗜鹽微生物（nonhalophilic）：生長不需NaCl，低濃度的NaCl即會對其生長產(chǎn)生抑制作用;（2）輕度嗜鹽微生物（slighthalophilic）：生長需少量NaCl，其生長最適NaCl濃度為1%～3%;（3）中度嗜鹽微生物（moderately halophilic）：生長需少量NaCl，其生長最適NaCl濃度為5%～10%;（4）極端嗜鹽微生物（extreme halophilic）：生長所需NaCl濃度為9%～32.5%，生長最適NaCl濃度為20%。再根據(jù)微生物菌株對堿的耐受力不同，也被分為了4類，分別為：（1）耐堿微生物（alkalotolerant microbes），pH值7～9生長，pH值>9.5不能生長;（2）嗜堿微生物（alkalophiles或稱嗜堿生物），pH值10～12生長;（3）極端嗜堿微生物（extreme alkaliphile），最適生長pH值≥10，pH值低于8.9～9則不生長，為專性極端嗜堿微生物;（4）兼性嗜堿微生物（facultative alkaliphile），指該微生物具有能在2種或2種以上不同環(huán)境下生存和繁衍后代的能力，如其既可以在pH>7的環(huán)境中生存，也可在pH<7的環(huán)境中生存。而根據(jù)耐堿性微生物菌株對鹽的耐受力，又可分為嗜堿菌和耐鹽性嗜堿菌。嗜堿菌為可以在pH>9的環(huán)境生長，在pH=10時生長最為良好，不需要高濃度的鹽環(huán)境。而耐鹽性嗜堿菌則在pH>9、鹽濃度為9%～32.5%的環(huán)境下也可生存[18]。由此可見，本研究中的阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）屬于耐鹽嗜堿微生物，具有較強的耐鹽堿能力。

阿氏芽孢桿菌除可耐鹽堿以外，在大分子降解、產(chǎn)物合成以及促進植物生長等方面也表現(xiàn)出突出作用，在一些國內外發(fā)明專利上，發(fā)表了阿氏芽孢桿菌在植物抗病害和促生長方面的作用。如李祖紅[19]等研究發(fā)現(xiàn)，阿氏芽孢桿菌對防治煙草黑脛病有顯著效果，且對人、畜、農(nóng)作物無害;另有證明阿氏芽孢桿菌AB211[20]可溶解無機磷酸鹽，合成鐵載體，并能產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）等激素。但是對于阿氏芽孢桿菌在鹽堿環(huán)境中既產(chǎn)生促生、又產(chǎn)生抗病的研究比較少，只有井大煒[21]等研究阿氏芽孢桿菌在重鹽堿環(huán)境中可促進怪柳的生長，但并未提到其抗病作用。在現(xiàn)實環(huán)境中，高鹽環(huán)境往往同時伴隨著高堿性，所以本研究中提到的阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）可在鹽堿環(huán)境中既起到促生又起到抗病的作用，具有更高的實際應用潛力。

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（責編：張宏民）