替格瑞洛對(duì)大鼠心肌梗死再灌注后心律失常及鈣離子通道影響

蔡青青，丁超，高亞松，聶蔚卓，蘇巖巖

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指短時(shí)間內(nèi)心肌血供中斷，在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供后，原缺血心肌發(fā)生較缺血時(shí)更為嚴(yán)重的損傷[1]。再灌注損傷將嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，它已成為現(xiàn)代冠心病領(lǐng)域的預(yù)防和治療的焦點(diǎn)。替格瑞洛是一種環(huán)戊基三唑嘧啶，作用于血小板P2Y12受體的拮抗劑。該藥物本身為活性前體，進(jìn)入體內(nèi)后能夠直接轉(zhuǎn)化為具有抗血小板作用的活性形式。許多研究說明，替格瑞洛可明顯降低缺血再灌注損傷，但替格瑞洛是否有電生理學(xué)效應(yīng)，目前的報(bào)道不多。本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究替格瑞洛對(duì)缺血再灌注后SD大鼠心室肌細(xì)胞跨膜鈣離子通道電流的影響，探討替格瑞洛拮抗再灌注心律失常的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：710293）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)區(qū)組法將大鼠分為3組，每組各8只。①假手術(shù)組（sham組）：只穿線不結(jié)扎。②心肌缺血再灌注動(dòng)物模型組（I/R組）：結(jié)扎左前降支30 min，再灌注120 min；③替格瑞洛組（ticagrelor組）：結(jié)扎術(shù)前2 h給SD大鼠灌胃替格瑞洛20 mg/kg。

1.3 心肌缺血再灌注（I/R）動(dòng)物模型建立用濃度25%的烏拉坦0.5 mg/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將針刺電極插入動(dòng)物左下肢、右上肢皮下記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。大鼠頸部切開1 cm左右的創(chuàng)口，用鑷子鈍性分離，暴露氣管，切開氣管，行氣管插管，連上小動(dòng)物呼吸機(jī)，進(jìn)氣量為1～1.5 ml/100 g，呼吸頻率為80～90 次/min。接著在大鼠胸骨旁約1 cm處，在第二、三肋間用剪刀剪開約2 cm的創(chuàng)口，用鑷子鈍性分離，剪開心包膜，暴露心臟，確認(rèn)左前降支的位置，左前降支的位置從主動(dòng)脈根部發(fā)出的，并把它分離出來，接著用3/8圓2.5×8不銹鋼圓針，帶5-0號(hào)絲線穿過左前降支，大約于左心耳下緣2 mm處穿針，進(jìn)針深度大概1 mm，寬度大概1.5 mm，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，接著絲線穿過一塑料套管，約1.5 mm高，在線的一端用主動(dòng)脈夾夾上，形成一個(gè)閉合線路，線路中間用撐胸器撐開，給予前降支壓迫，使其缺血，壓迫30 min后，將撐胸器取出，壓迫解除，缺血心肌恢復(fù)血流，即心肌開始再灌注。再灌注120 min。模型制備成功的標(biāo)志是心電圖上出現(xiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高的改變，壓迫的心肌因缺血變得蒼白。壓迫接觸后，心肌恢復(fù)血流，開始再灌注，心肌由蒼白變得紅潤，在開始灌注的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)再灌注心律失常。在建立大鼠心肌缺血再灌注模型過程中，一直記錄心電圖，觀察大鼠心肌再灌注后出現(xiàn)的室性期前收縮、室性心動(dòng)過速及室顫等心律失常情況，心律失常診斷標(biāo)準(zhǔn)按照Lambeth會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)[5]，評(píng)分采用Curtis-Walker評(píng)分規(guī)則[6]，對(duì)心律失常嚴(yán)重程度進(jìn)行定量分析。

1.4 心室肌細(xì)胞的分離大鼠心肌缺血再灌注20 min后，迅速開胸，用剪刀剪下大鼠的心臟，然后把心臟放在冰過的無鈣臺(tái)式液里，修剪心臟后，將主動(dòng)脈套在灌流套管上，用0號(hào)線固定好，接下來，把心臟懸掛在Langendorf灌流系統(tǒng)上經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流。用無鈣臺(tái)式液灌流心臟約5 min，直到心臟停跳之后，再換酶液（30 ml的無鈣臺(tái)式液中含15 mg的膠原酶Ⅱ），循環(huán)灌流15～18 min，待心臟變得松軟，摘下心臟放在KB液中，把左心室剪碎，用粗頭的吸管輕輕反復(fù)吹打，用無菌的200 μm濾網(wǎng)過濾之后，將收獲的心室肌細(xì)胞室溫靜置使存活心肌細(xì)胞沉降，更換新鮮KB液，室溫靜置40 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取條紋清晰的心室肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)行下一步膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄按Hamill法進(jìn)行[7]，在玻璃微電極內(nèi)充滿內(nèi)液。玻璃微電極電阻2.5～3.0GΩ。將玻璃微電極連在裝電極的裝置。之后用吸管吸取上述靜置40 min的心室肌細(xì)胞數(shù)滴滴入灌流槽中。之后把灌流槽放在顯微鏡下，2 min后，細(xì)胞沉到灌流槽底，用鈣外液灌流，沖去已經(jīng)死亡的細(xì)胞碎片。在顯微鏡下選取表面光潔，紋路清晰的心室肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象。使用三維液壓微操縱器操縱電極靠近細(xì)胞，進(jìn)行封接，達(dá)到1GΩ以上，吸破心室肌細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄。所有實(shí)驗(yàn)在室溫（20℃～25℃）下進(jìn)行。

1.6 心肌細(xì)胞L型鈣電流的記錄應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在室溫（20℃～25℃）下記錄心室肌細(xì)胞的L型鈣通道，心室肌細(xì)胞L型鈣電流。心室肌鈣電流采用電壓鉗的方法進(jìn)行記錄，所拉制的電阻為1.5～2.5MΩ。ICa-L電極外液（mM）：TEA-Cl 140，MgCl22，HEPES 10，Glucose 10，CaCl21.8，用CsOH調(diào)pH值為7.4。ICa-L電極內(nèi)液（mM）：CsCl 120，TEA-Cl 20，HEPES 10，EGTA 10，用CsOH調(diào)pH值為7.2。ICa-L記錄：激活程序：從維持電壓（HP）-40 mV，階躍+5 mV，逐步去極化到+60 mV，時(shí)程300 ms。以不同鉗制電壓下的ICa-L密度繪成電流-電壓（I-V）曲線。失活程序：采用雙脈沖刺激法，HP為-50 mV，條件脈沖-80 mV -+40 mV，鉗制時(shí)間500 ms，階躍+10 mV，每次條件脈沖后緊跟一固定的去極化到+10 mV的測試脈沖，持續(xù)時(shí)間250 ms，將記錄到的L型鈣電流與最大激活時(shí)的L型鈣電流作對(duì)比，與相應(yīng)的條件脈沖膜電位作圖得鈣通道失活曲線。ICa-L幅值以內(nèi)向電流峰值與100 ms后的電流值之差計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示組間比較采用方差分析。以P＜0.05為顯著性差異的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 替格瑞洛對(duì)缺血再灌注心律失常的影響假手術(shù)組僅出現(xiàn)少量室性期前收縮（2.1±1.25次），未發(fā)生室性心動(dòng)過速及室顫，心律失常評(píng)分0.50±0.19分；與假手術(shù)組相比，I/R組室性期前收縮發(fā)生率、室性心動(dòng)過速和室顫持續(xù)時(shí)間、室性心動(dòng)過速和室顫發(fā)生率以及心律失常評(píng)分均明顯增加（P均＜0.05）；與I/R組相比，ticagrelor組室性期前收縮發(fā)生次數(shù)、室性心動(dòng)過速持續(xù)時(shí)間、室性心動(dòng)過速發(fā)生率以及心律失常評(píng)分明顯降低（P均＜0.05）（表1，圖1）。

表1 各組大鼠心律失常發(fā)生情況的檢測結(jié)果

圖1 四種類型的心電圖

2.2 替格瑞洛對(duì)缺血再灌注后L型鈣通道的影響假手術(shù)組的L型鈣通道的峰值電流密度為（-4.3±0.5 pA/pF，n=15），半數(shù)激活電壓為（-14.6±0.8 mV，n=15），半數(shù)失活電壓為（-26.0±1.1 mV，n=10）。與假手術(shù)組相比，I/R組L型鈣電流密度明顯增高（峰值電流密度為-9.4±0.6 pA/pF，n=15，P＜0.05），I/R組不影響L型鈣通道的激活過程（半數(shù)激活電壓為-13.1±0.7 mV，n=15 ，P＞0.05），I/R組明顯減慢心肌缺血再灌注L型鈣通道的失活過程（半數(shù)失活電壓為-22.7±0.8mV，n=14，P＜0.05）；與I/R組相比，ticagrelor組的L型鈣電流密度明顯降低（峰值電流密度為-7.1±1.0 pA/pF，n=9，P＜0.05），ticagrelor組不影響L型鈣通道的激活過程（半數(shù)激活電壓為-13.7±0.7 mV，n=9，P＞0.05），與I/R組相比，替格瑞洛明顯加快心肌缺血再灌注L型鈣通道的失活過程（半數(shù)失活電壓為-25.7±0.6 mV，n=9，P＜0.05）。（圖2示3組細(xì)胞典型的L型鈣電流形態(tài)曲線；圖3示替格瑞洛對(duì)L型鈣通道電流密度的影響；圖4示替格瑞洛對(duì)L型鈣通道激活過程的影響；圖5示替格瑞洛對(duì)L型鈣通道激活過程的影響） 。

圖2 3組細(xì)胞典型的L型鈣電流形態(tài)曲線

圖3 替格瑞洛對(duì)L型鈣通道電流密度的影響。（A） L型鈣電流的電流電壓曲線（B）L型鈣電流的峰值電流密度

3 討論

圖4 替格瑞洛對(duì)L型鈣通道激活過程的影響

圖5 替格瑞洛對(duì)L型鈣通道失活過程的影響。（A）替格瑞洛對(duì)L型鈣通道穩(wěn)態(tài)失活曲線（B）L型鈣通道穩(wěn)態(tài)失活曲線的V1/2值

心肌再灌注損傷是指因血流突然中斷而缺血的心肌的部分或全部在血流恢復(fù)供應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的損傷。尤其是再灌注心律失常，是缺血再灌注期患者猝死的一個(gè)重要原因。臨床上抗心律失常藥物通常直接作用在阻斷某一種離子通道上，但這些作用通常對(duì)室性快速心律失常療效欠佳。

P2Y12受體拮抗劑對(duì)急性心肌梗塞患者血小板聚集抑制和動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的預(yù)防起著重要的作用[8]。而替格瑞洛是一種新型的P2Y12受體拮抗劑，其抗血小板作用比氯吡格雷速度更快、作用更大、性質(zhì)更穩(wěn)定[2]。國內(nèi)外的基礎(chǔ)及臨床研究表明，替格瑞洛可能會(huì)增加腺苷的血漿濃度，可能是通過1型平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制細(xì)胞攝取腺苷，導(dǎo)致腺苷的血漿濃度增加[9,10]。

再灌注損傷的原因尚不明確，可能與Ca2+超載有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛可降低心肌缺血再灌注期間室早的發(fā)生次數(shù)、室速及室顫的持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率。心肌缺血再灌注后，L型鈣電流明顯增高，替格瑞洛可使增高的L型鈣電流下調(diào)，逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)，可能為替格瑞洛防治再灌注失常的細(xì)胞學(xué)離子機(jī)制。替格瑞洛可能通過兩條途徑發(fā)揮抗心律失常作用：一方面通過鈣拮抗作用，提高室顫閾，增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；另一方面，通過非抗血小板的作用，引起循環(huán)血液中的腺苷濃度的增加。腺苷濃度的增加，可以對(duì)再灌注損傷起保護(hù)作用。有研究表明，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后的患者應(yīng)用腺苷治療，心肌梗死面積可減少。敲除平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體（ENT）的小鼠也可減少再灌注后心肌梗死面積。外源性腺苷輸入到血管，可抑制ENT，從而引起內(nèi)源性腺苷濃度的增加，從而發(fā)揮保護(hù)心臟作用。腺苷能夠阻抑嗜中性粒細(xì)胞的活化，防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷。也許腺苷的這種作用機(jī)制在心肌缺血再灌注損傷中起的作用很重要。但目前仍未闡述清楚腺苷對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

由于替格瑞洛對(duì)1型平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體的親和力及血清蛋白的強(qiáng)結(jié)合力，具有促進(jìn)紅細(xì)胞ATP釋放和抑制紅細(xì)胞攝取腺苷的聯(lián)合作用，可提高患者循環(huán)血液中局部腺苷的濃度，從而可產(chǎn)生相關(guān)的臨床作用。而目前，腺苷介導(dǎo)模式的作用在何種程度上有助于替格瑞落的臨床獲益尚未闡述清楚，還需要進(jìn)一步的研究，以更好的指導(dǎo)替格瑞洛在臨床上的使用。