葉酸對母嬰分離引起小鼠成年焦慮樣行為影響的初探

邸 桐 趙智婕 包金風(fēng)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010110，中國

焦慮癥（anxiety）是最常見的精神疾病之一，主要表現(xiàn)為過度擔(dān)心、過度興奮和恐懼等。焦慮障礙的存在是導(dǎo)致其他焦慮、情緒障礙和藥物濫用的危險(xiǎn)因素。共病發(fā)展使原發(fā)性和繼發(fā)性疾病的治療更加困難，導(dǎo)致緩解率低、預(yù)后不良和自殺風(fēng)險(xiǎn)等。研究表明，大約三分之一的兒童在成年之前會經(jīng)歷焦慮癥［1］。大量的臨床和流行病學(xué)研究表明，焦慮與早期的不良環(huán)境有關(guān)，如母愛缺失等［2］?！岸脊W(xué)說”即健康與疾病的發(fā)育起源（developmental origins of health and disease，DOHAD）學(xué)說認(rèn)為在動物胚胎期和早期發(fā)育的關(guān)鍵窗［3］，不良的環(huán)境可引起機(jī)體組織器官結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改變，從而增加其神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管等系統(tǒng)多種疾病的易感性。早期不良環(huán)境包括嚴(yán)重的大氣污染［4］、兒童期遭受虐待、母親飲酒［5］，尤其是母愛缺失［6］，可能引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感性增加，對個(gè)體身心發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。青少年期是一個(gè)特別重要的生命時(shí)期，研究此時(shí)應(yīng)激暴露對神經(jīng)系統(tǒng)疾病和認(rèn)知功能［7］的影響十分重要。

葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是一種在人體內(nèi)不能自主合成，必須依靠外源性供給的水溶性B 族維生素。其在DNA、RNA 的合成和DNA 甲基化等過程中起重要的作用。孕期給予葉酸可預(yù)防新生兒神經(jīng)管畸形等。近年來，研究表明葉酸缺乏可能也與多動癥和孤獨(dú)癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Tsuchimine S 等［8］的研究發(fā)現(xiàn)患有抑郁癥的青少年和兒童體內(nèi)葉酸明顯低于對照組，但葉酸是否能夠改善早期不良環(huán)境引起的成年小鼠行為和認(rèn)知功能目前未見報(bào)道。母嬰分離模型，被認(rèn)為是對子代行為及神經(jīng)發(fā)育影響研究的最有效模型之一［9］，經(jīng)母嬰分離的小鼠，會引起后代生理和神經(jīng)遞質(zhì)功能的紊亂，其成年后會出現(xiàn)認(rèn)知障礙和焦慮抑郁行為等［10］。因此本實(shí)驗(yàn)采用母嬰分離經(jīng)典應(yīng)激模型，模擬人類的環(huán)境-心理應(yīng)激，研究給予葉酸對早期不良環(huán)境作用下小鼠行為學(xué)和認(rèn)知功能的影響，為葉酸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 母嬰分離模型

昆明小鼠，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（蒙）2015-0001，6～8 周雌雄交配，新生鼠出生當(dāng)天記作0 d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)用到新生鼠的數(shù)目為41 只，同一時(shí)間新生的小鼠4 窩，其中每一窩將分成三個(gè)部分，對照組（不分離），模型組（母嬰分離+生理鹽水），葉酸組（母嬰分離+葉酸）如Fig.1。母嬰分離操作步驟為用酒精擦拭過的鑷子將26 只幼崽輕柔夾出，每日小鼠分離至另一充滿墊料籠子4 h，分離28 d。待小鼠長至14 d，分離同時(shí)每日腹腔注射葉酸28 d，劑量為5 mg·kg-1，體積為0.1 mL 每10 g，此為葉酸組，數(shù)目為13 只；母嬰分離組數(shù)目也為13 只，同上進(jìn)行分離操作每日4 h，持續(xù)28 d待小鼠長至14 d，分離同時(shí)每日腹腔注射生理鹽水（normal saline，NS）0.1 mL 每10 g，注射28 d；正常組則為不進(jìn)行分離操作。每周記錄體重。待各組小鼠成年后約第10 周進(jìn)行小鼠行為學(xué)檢測。

1.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 曠場實(shí)驗(yàn)（open-field test，OFT）

曠場為一個(gè)50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前適應(yīng)曠場15 min。24 h 后小鼠置于曠場的一個(gè)角，攝像機(jī)記錄和評估5 min 的活動，觀察小鼠進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)及時(shí)間、直立次數(shù)。每一只鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需將曠場箱內(nèi)鼠的排泄物清理干凈，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭，晾干后方可進(jìn)行下一只動物的實(shí)驗(yàn)，以避免氣味對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.2 十字高架實(shí)驗(yàn)（elevated plus maze test，EPM）

Fig.1 Process diagram

開始時(shí)手持小鼠，使其背對實(shí)驗(yàn)人員，放置在開臂與閉臂接合處的中心區(qū)，讓小鼠面對開放臂。放置好鼠后，實(shí)驗(yàn)人員迅速遠(yuǎn)離，用攝像機(jī)記錄5 min 內(nèi)小鼠在高架十字迷宮內(nèi)的活動情況，觀察小鼠進(jìn)入開放臂和閉合臂次數(shù)及時(shí)間、直立次數(shù)。每一只鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需將迷宮內(nèi)鼠的排泄物清理干凈，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭，晾干后方可進(jìn)行下一只動物的實(shí)驗(yàn)，以避免氣味對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.3 新奇事物識別實(shí)驗(yàn)（novel object recognition test，NORT）

曠場為一個(gè)50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前適應(yīng)曠場15 min。24 h 后放入小鼠，此時(shí)曠場內(nèi)放入兩個(gè)形狀大小顏色相同的物體A，記錄并觀察。24 h 后將其中一個(gè)A 物體換成一個(gè)大小顏色相同但形狀不同的物體B，攝像機(jī)記錄并觀察5 min，見（Fig.2）。結(jié)果以分辨指數(shù)（distinguish index，DI）來表示，分辨指數(shù)計(jì)算公式為：DI=N/（N+F）100%，式中N 為探索新物體所用的時(shí)間，F(xiàn) 為探索舊物體所用的時(shí)間。每只動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需將敞箱內(nèi)的排泄物全部清理，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭敞箱和物體A 或B，晾干后進(jìn)行下一只動物的實(shí)驗(yàn)，以避免氣味對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.4 明暗箱實(shí)驗(yàn)（light/dark box test，LDBT）

明暗箱實(shí)驗(yàn)利用小鼠對明亮地方的好奇與厭惡的這種矛盾心理，評估小鼠焦慮相關(guān)行為。明暗箱為自制玻璃箱30 cm×30 cm×80 cm，不封閉的明箱占裝置的3/5，完全涂成白色，而暗箱占箱子的2/5，全部涂成黑色。中間有隔斷將裝置分為明箱和暗箱，暗箱有頂蓋。在明暗箱之間的隔斷底部留有一個(gè)7 cm×7 cm 的出入口。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將小鼠置于背朝著出入門的明箱中央，觀察5 min 內(nèi)小鼠的活動情況。觀察指標(biāo)為記錄明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)開始前將明暗箱用75%酒精徹底擦拭，以排除前一個(gè)小鼠的殘留氣味對下一個(gè)小鼠行為的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。由于大多數(shù)行為數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布的，所以使用了非參數(shù)檢驗(yàn)，當(dāng)接受H1時(shí)，繼續(xù)用Kruskal-Wallis H 法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對照組進(jìn)入中間格子的次數(shù)為（15.15±0.92）次，模型組進(jìn)入中間格子的次數(shù)為（11.15±1.47）次，葉酸組進(jìn)入中間格子次數(shù)為（17.93±1.26）次。相比于對照組，母嬰分離操作可以使小鼠進(jìn)入中間格子次數(shù)減少（P＜0.05）。給予葉酸后，可使小鼠進(jìn)入中間格子次數(shù)顯著增加（P＜0.01）；同時(shí)小鼠進(jìn)入曠場中心時(shí)間，對照組（21.49±1.27）s，模型組（17.00±1.94）s，葉酸組（26.12±1.22）s。但在進(jìn)入曠場時(shí)間上模型組與對照組無顯著差異（P=0.1），而模型組與葉酸組有顯著差異（P＜0.01）。垂直運(yùn)動水平站立次數(shù)無明顯差異（Fig.3）。

2.2 十字高架實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig.2 Novel object recognition

Fig.3 Open-field test

對照組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比為（24.07±4.344）%，模型組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比為（7.943±3.731）%，葉酸組為（10.17±2.947）%（P＜0.01）。對照組在開臂時(shí)間百分比為（8.516±1.91）%；模型組（1.385±0.522 8）%，葉酸組（3.077±1.332）%。相比于對照組，模型組在開臂次數(shù)和時(shí)間明顯降低（P＜0.01），但葉酸組與模型組比較無顯著性差異。在豎直運(yùn)動中，站立次數(shù)各組無顯著性差異（Fig.4）。

2.3 新事物識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在新事物識別實(shí)驗(yàn)中，對照組小鼠識別率為（0.56±0.01），模型組小鼠識別率為（0.46±0.018），葉酸組小鼠識別率為（0.54±0.018）。采用單因素方差分析可知，與對照組相比，母嬰分離可使小鼠對新事物識別率顯著降低（P＜0.001），而葉酸可以使小鼠對新事物識別率明顯提升（P＜0.01）（Fig.5）。

2.4 明暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在明暗箱實(shí)驗(yàn)中，對照組小鼠明箱停留時(shí)間百分比為（58.35±6.048）%，穿梭總次數(shù)為（35.25±1.656），模型組小鼠箱停留時(shí)間百分比為（22.11±3.815）%，穿梭總次數(shù)為（35.5±2.267）；葉酸組小鼠箱停留時(shí)間百分比為（50.76±9.832）%，穿梭總次數(shù)為（24.93±1.787）。采用單因素方差分析可知，在小鼠停留明箱時(shí)間上，與對照組相比，母嬰分離使小鼠在明箱時(shí)間顯著降低（P＜0.001），而葉酸可以使小鼠在明箱時(shí)間明顯延長（P＜0.01）。在穿梭總次數(shù)上，母嬰分離操作沒有影響小鼠的活動能力。但發(fā)現(xiàn)使用葉酸后小鼠穿梭減少，更傾向于在停留在明箱（Fig.6）。

3 討論

研究表明，葉酸對早期生活至45 歲以后的健康至關(guān)重要［11］。目前我們所知葉酸可阻止神經(jīng)管畸形的發(fā)生，以及預(yù)防特定風(fēng)險(xiǎn)人群的癌癥發(fā)生［12］、預(yù)防阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）及其它神經(jīng)退行性疾病［13］等。最近的研究發(fā)現(xiàn)妊娠期母親補(bǔ)充葉酸可以使30 月齡兒童表達(dá)語言得分提高［14］，而整個(gè)妊娠期補(bǔ)充葉酸對于改善早期運(yùn)動反射發(fā)育和子代的空間學(xué)習(xí)和記憶能力將更有效［15］。Shona SI 的研究［16］也證實(shí)了葉酸對產(chǎn)前暴露于丙戊酸鈉（valproate，VPA）的小腦神經(jīng)毒性保護(hù)的作用。新事物識別實(shí)驗(yàn)是利用動物先天對新物體有探索傾向的原理建立，使動物在自由狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測試，相比與對照組母嬰分離操作可使小鼠對新事物識別率顯著降低，而葉酸可以使小鼠對新事物識別率提升，這與Lehmann［17］等研究結(jié)果一致。Macrt 和Laviola 研究［18］顯示，早年經(jīng)歷母愛剝奪的小鼠，在青春期出現(xiàn)社交能力降低、性行為減少。我們的研究結(jié)果顯示，在曠場實(shí)驗(yàn)和明暗箱實(shí)驗(yàn)中，模型組進(jìn)入曠場中心次數(shù)及進(jìn)入明箱時(shí)間比例顯著低于對照組，而葉酸可以增加小鼠的水平活動能力，說明早年經(jīng)歷母嬰分離小鼠成年后存在新奇環(huán)境中的緊張、焦慮水平增加和探索行為減少，而葉酸可以初步改善早期經(jīng)歷母愛剝奪所造成的在新環(huán)境中的緊張和焦慮狀態(tài)。在十字高架迷宮，嚙齒類動物面對新奇刺激與嗜暗天性時(shí)造成了探究與回避的沖突行為［19］，從我們的結(jié)果也可知母嬰分離使小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)減少，產(chǎn)生焦慮；其中葉酸組呈現(xiàn)開臂活動增加的趨勢，但與模型組比較結(jié)果未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們推測可能因小鼠個(gè)體差異較大。然而目前有關(guān)葉酸的研究主要集中在妊娠期，對出生后研究及對情緒研究較少。

Fig.4 Elevated plus maze test (EPM)

Fig.5 Percentage of novel object in novel object recognition (NOR)

Fig.6 Light and dark box test (LDB)

綜上所述，嚙齒類母愛剝奪影響其子代的行為，這提示生命早期不良環(huán)境持久影響身心健康［20］。但生命早期不良社會環(huán)境對精神健康的影響則可以通過人為干預(yù)逆轉(zhuǎn)的，如藥物、豐富環(huán)境［21］等，這與我們的研究結(jié)果一致，我們的初步的研究結(jié)果表明，葉酸可以改善早期不良環(huán)境對小鼠造成的焦慮行為和認(rèn)知缺陷。由于我們的樣本量偏小，母嬰分離模型還在摸索階段，并未涉及分子機(jī)制層面的研究，但有關(guān)其作用和機(jī)制我們正在進(jìn)一步研究中。