表面活性劑對地表水中微生物的毒性效應(yīng)

車陽麗,魏小芳,張 周,鐘瑤瑤,張 群,劉 芳,3*,劉春爽,3

表面活性劑對地表水中微生物的毒性效應(yīng)

車陽麗1,魏小芳2,張 周1,鐘瑤瑤1,張 群2,劉 芳1,3*,劉春爽1,3

(1.中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院,山東 青島 266580；2.中國石油勘探開發(fā)研究院提高采收率國家重點實驗室,北京 100083；3.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室,北京 102206)

研究了甜菜堿和石油磺酸鹽表面活性劑對地表水中微生物的數(shù)量和代謝活性的影響,并基于菌群16S rRNA基因的高通量測序,比較分析了表面活性劑作用前后微生物群落結(jié)構(gòu)的變化.結(jié)果表明,兩種表面活性劑脅迫下微生物的生長活性均遵循低濃度促進、高濃度抑制的作用規(guī)律,表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性.與空白組相比,在1.5g/L的表面活性劑的作用下,微生物數(shù)量、蛋白質(zhì)含量以及脫氫酶的活性均明顯降低,且同濃度下的甜菜堿表現(xiàn)出更高的生物毒性;菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn),腸桿菌屬()以高于75%的比例成為所有樣本中的優(yōu)勢菌屬,從各組來看石油磺酸鹽可有效提高腸桿菌屬()的相對豐度,對假單胞菌屬()和根瘤菌屬()抑制作用顯著;而甜菜堿則可明顯增加假單胞菌屬()和寡養(yǎng)單胞菌屬()的菌屬比例,抑制腸桿菌屬()和根瘤菌屬()的繁殖;通過表面活性劑與純種菌的作用發(fā)現(xiàn),表面活性劑可通過擾亂細菌的生長周期、破壞細胞膜結(jié)構(gòu)來干擾細胞的正常生理功能,從而使其活性降低甚至死亡.

甜菜堿；石油磺酸鹽；表面活性劑；生物毒性；群落結(jié)構(gòu)

在能源需求量持續(xù)增加而新能源尚未普及的形勢下,提高石油等常規(guī)能源的采收率成為緩解能源緊張的重要舉措.目前,我國各油田依次進入三次采油階段,各種化學(xué)驅(qū)油技術(shù)應(yīng)運而生,如化學(xué)驅(qū)油、混相驅(qū)油、熱力驅(qū)油以及微生物驅(qū)油等.其中,表面活性劑驅(qū)油作為一種常見的化學(xué)驅(qū)油技術(shù),因具有投資低、收益高的特性被各大油田廣泛采用[1-2].表面活性劑是一類含有“雙親”官能團(親水親油基)、可使表面張力顯著下降的有機物[3],按溶于水后的帶電性質(zhì)可以將其分為非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑.其中,由于地層巖石表面一般帶有負電荷,陽離子表面活性劑基本被排除在驅(qū)油體系之外.非離子基團的親水性要比離子性基團差得多,且非離子表面活性劑在地層中穩(wěn)定性較差,吸附消耗量大于陰離子表面活性劑,因此使用范圍較小[4].在陰離子表面活性劑體系中,石油磺酸鹽以高效的界面活性、原料易得和成本較低等優(yōu)勢成為驅(qū)油劑體系中的“佼佼”者.近年來,面臨著原油開采深度增加、高礦化度、地層溫度高的挑戰(zhàn),對表面活性劑的性能也提出了更高的要求,在此背景下,具有良好的配伍性、耐高溫、同時含有陰陽離子基團的甜菜堿兩性表面活性劑脫穎而出,同時它可以螯合金屬離子,對高礦化度的油層具有較強的適用性,得到了研究者們的廣泛關(guān)注[5-6].

表面活性劑廣泛應(yīng)用于油田生產(chǎn)以及日常生活中的各個方面,在我們的生活發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[7-9],同時,這也導(dǎo)致人們往往只關(guān)注于它帶來的便利,卻忽略了其可能在使用的過程中進入水體,對生態(tài)環(huán)境造成潛在危害.前期研究指出[10],1mg/L的表面活性劑就可在水體表面形成泡沫隔離層,阻礙氣體交換致使水體發(fā)臭;表面活性劑與生物細胞膜之間的電子效應(yīng)可增加兩者之間的接觸比例,增加膜的通透性造成細胞死亡[11];表面活性劑還可以通過乳化作用增加水體中油類等疏水性污染物的濃度,打破水生態(tài)系統(tǒng)的平衡發(fā)展等.合理應(yīng)用表面活性劑、降低可能帶來的環(huán)境隱患是保障其發(fā)揮最大經(jīng)濟效益的前提.因此,有必要對新研制的表面活性劑進行環(huán)境效應(yīng)評估,建立表面活性劑的生態(tài)毒性評價機制.

微生物生長活性的變化可以直接反映出水體受污染程度,將微生物作為表面活性劑毒性監(jiān)測的指示者具有一定的實用價值[12].然而,目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的表面活性劑生物毒性的檢測方法和評價標準,在室內(nèi)評價中研究者們通常以單種菌作為受試物種來考察其毒性效應(yīng),為表面活性劑與分離菌之間的作用機理提供指導(dǎo)意義[13-14],但筆者認為在微生物物種的選擇上缺乏一定的代表性和廣泛性,未能提供微生物群落的全面信息,降低了實驗的可信度.而近年發(fā)展起來的高通量分子生物學(xué)技術(shù)(又稱“第二代測序技術(shù)”)則可有效避免此問題的產(chǎn)生,它不僅具有覆蓋面廣、通量高、測序周期短的特點[15],而且有效克服大部分微生物無法培養(yǎng)的難題[16].綜合考慮,本文以廣泛應(yīng)用的石油磺酸鹽(KPS)為對照,采取傳統(tǒng)培養(yǎng)法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法考察新研制的甜菜堿表面活性劑(TCJ)對地表水中微生物的毒性效應(yīng),并對兩者之間的作用機理作出預(yù)測,為表面活性劑生態(tài)效應(yīng)評估體系的建設(shè)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 水樣的采集與預(yù)處理 本實驗所用水樣取自山東省青島市漓江西路與江山南路交匯處西北方向的岔河地表水(120°10'E,35°56'N),其地理位置及周圍環(huán)境如圖1所示.該河道自北向南最終流入唐島灣海,水體表觀較清澈,取樣時間為2018年11月,采樣時將取水器置于液面下約30cm處,避免漂浮性物質(zhì)進入水體.采樣完畢后,盡快運送至實驗室,置于4℃冰箱低溫保存,備用.

圖1 采樣點位置分布

1.1.2 主要儀器及試劑 蘇州凈化BCM-1000型生物凈化工作臺、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計、SPX-250B生化培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、LDZM立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、MiSeq測序儀(美國Illumina公司)等;Q5高保真DNA聚合酶(美國NEB公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國AXYGEN公司);實驗用表面活性劑為克拉瑪依石油磺酸鹽(KPS),棕黑色膏狀物,常溫下不易溶解;白色甜菜堿型(TCJ)表面活性劑由中國石油勘探開發(fā)研究院提供,白色濃稠液狀,與水混合后呈渾濁的水化固體狀態(tài).

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的富集與培養(yǎng) 細菌富集營養(yǎng)液成份(g/L):水1L,NH4Cl 1.67g,NaNO32.65g,K2HPO40.6g, MgSO4·7H2O 0.25g,牛肉膏2g,蛋白胨5g,pH值7.2~7.4.培養(yǎng)基組成(MSM g/L):水1L, NaCl 1g, (NH4)2SO41.25g,NaNO32g, KH2PO43g,K2HPO41.5g, MgSO4·7H2O 0.25g,葡萄糖2g,pH值7.2~7.4.固體培養(yǎng)基的制備:稱取5.0g NaCl和10.0g蛋白胨溶于1L去離子水中,在微熱狀態(tài)下加入5.0g牛肉膏攪拌至溶解,然后加入16g瓊脂繼續(xù)加熱至煮沸.121℃條件下滅菌處理30min后將其倒至培養(yǎng)皿中,凝固后備用.

表面活性劑作用下地表水微生物的培養(yǎng):以地表水為接種源,營養(yǎng)液為細菌富集培養(yǎng)基.用無菌槍頭吸取地表水樣品加入滅菌后的細菌富集培養(yǎng)液中,構(gòu)建地表水本源微生物的培養(yǎng)體系.待細菌繁殖進入對數(shù)生長期后按2%的添加量將菌液轉(zhuǎn)移到無機鹽培養(yǎng)基(MSM)中,同時向其中加入表面活性劑溶液,使其最終濃度分別為0,0.1,0.2,0.3,0.6,0.9,1.2和1.5g/L,封口膜包裝后置于37℃、160r/min的培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)2d.

培養(yǎng)結(jié)束后,從各份培養(yǎng)基中吸取10mL菌液在5000r/min的轉(zhuǎn)速下離心處理10min,倒掉上清液后加入10mL無菌水洗滌3次以除去細胞表面殘存的表面活性劑,最后將細菌重懸于10mL無菌水中,低溫保存用于后續(xù)蛋白質(zhì)和脫氫酶活性的測定實驗.

1.2.2 表面活性劑生物毒性的測定 分別從生物量、蛋白質(zhì)含量的多少以及脫氫酶活性的高低三方面評判表面活性劑對地表水微生物的生物毒性.

生物量的確定采用稀釋平板涂布法[17],取表面活性劑作用下的菌液1mL置于9mL無菌水中按梯度稀釋至10-6、10-7稀釋度,取此稀釋度的菌液涂布于固體瓊脂平板上,每個稀釋倍數(shù)下設(shè)立3個平行樣,選取菌落數(shù)在30~300CFU范圍內(nèi)的平板進行菌數(shù)統(tǒng)計,換算出每毫升菌液中的細菌個數(shù),并按公式(1)進行抑菌率的計算[18].

式中:為抑菌率,%;0為無表面活性劑作用的空白組菌落個數(shù),CFU/mL,為表面活性劑作用下的實驗組菌落個數(shù),CFU/mL.

采用考馬斯亮藍法[19-20]對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量進行測定.向洗滌重懸后的菌液中加入NaOH,高溫煮沸15min使細胞裂解.待其冷卻至室溫后,用移液槍吸取1mL混合液,加入5mL考馬斯亮藍充分混勻,顯色穩(wěn)定后于595nm處測定其吸光度,并根據(jù)標準曲線推算出不同表面活性劑作用下的菌液的蛋白質(zhì)濃度.

脫氫酶是一種常用來表征微生物活性的指標,其活性的大小可以反映活細胞對有機質(zhì)的降解利用強度[21].目前,常采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法對脫氫酶活性進行測定[22-23],以三氯甲烷萃取還原生成的紅色三苯基甲贊(TF),分層后用紫外可見分光光度計測定有機相樣品在485nm波長處的吸光度,以1mL菌懸液1h生成的TF含量為一個酶活力單位,根據(jù)標準曲線推算出生成的TF濃度.脫氫酶活性 = TF濃度(μg/mL)/培養(yǎng)時間

1.2.3 高通量測序 為滿足測序要求,需對地表水本源微生物擴大培養(yǎng).為此,以地表水為接種源,無機鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,建立無表面活性劑干擾的空白對照組、濃度各為100mg/L的TCJ和KPS作用下的實驗組培養(yǎng)體系,同時每組設(shè)立3個平行.培養(yǎng)完成后取各組水樣用0.20μm的聚碳酸酯膜抽濾處理,收集到的菌體濾膜置于無菌離心管中,用干冰保存后送至上海派森諾生物科技有限公司進行后續(xù)DNA的提取測定.

PCR擴增:分別以338F (5’-ACTCCTACGG GAGGCAGCA-3’)和806R (5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’) 作為特異性引物,采用Q5高保真DNA聚合酶對標準細菌的16S rRNA 基因V3+V4區(qū)進行PCR擴增,其擴增片段長度約為468bp.前引物338F中5’連有一個寡核苷酸序列(barcode),用以區(qū)分不同的樣品.PCR擴增體系及反應(yīng)程序如表1所示.

擴增完成后,采用瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測確認,切取目的片段并采用Promega QuantiFluor系統(tǒng)對其進行熒光定量,按所需測序量對樣本進行混樣處理,然后在Illumina Miseq平臺進行2×250bp雙端測序.

數(shù)據(jù)處理:為保證測序質(zhì)量,需要對測序過程中產(chǎn)生的堿基替換、嵌合體等疑問序列進行有效去除,運用QIIME軟件對相似度397%的保留序列進行歸并及可操作分類單元(OTU)的劃分,選取每個OTU中的高豐度代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比對,獲取各單元內(nèi)物種從門到種分類水平上的豐富度及菌群微生物多樣性指數(shù),用以組間的相似性及差異性分析.

表1 細菌PCR擴增體系及反應(yīng)程序

1.2.4 表面活性劑作用于純種菌的機理探究 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為模式菌,從其生長趨勢、細胞膜通透性以及細胞形態(tài)三方面入手探究表面活性劑與細菌之間的作用機理.

生長曲線的測定采用光電比濁法[24],分別取OD600=1.0的純種菌懸液1mL于100mL無菌液體培養(yǎng)基中,向其中加入TCJ和KPS溶液使其最終濃度為1.5g/L.培養(yǎng)過程中定時取出10mL菌液,以5000r/min的速度離心10min并等體積重懸.然后以無菌水做參比,于600nm波長處測定菌懸液的吸光度,繪制菌體的生長曲線.

碘化丙啶(PI)作為一種細胞核染色試劑,可透過破損的細胞膜與雙鏈DNA結(jié)合釋放出紅色熒光,但卻對活細胞“無能為力”.因此,可利用它來檢測細胞的存活狀態(tài)[25].實驗中,選取未受表面活性劑干擾和與表面活性劑混勻培養(yǎng)的菌液,離心后向菌體沉淀物中加入磷酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L)和1mg/mL的PI染色液,置于暗處反應(yīng)20min完成染色.隨之取一滴染色后的菌液于載玻片上,通過倒置熒光顯微鏡觀察制備樣本并拍照.

利用掃描電子顯微鏡對表面活性劑作用前后的和細胞形態(tài)進行觀察.首先,取適量正常培養(yǎng)和添加1.5g/L的表面活性劑條件下培養(yǎng)的菌液,利用磷酸鹽緩沖溶液進行沖洗以除去菌體表面的分泌物和表面活性劑,然后利用質(zhì)量分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液和1%的鋨酸進行雙固定.之后,采用一系列質(zhì)量分數(shù)分別為30%,50%, 70%,90%和100%的乙醇溶液對細菌進行脫水處理,并置于超臨界CO2環(huán)境下進行過夜干燥,最后在掃描電鏡下觀察并拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 水質(zhì)分析結(jié)果

實驗用水的基本理化因子如表2所示,總體來看,表觀清澈的地表水呈弱堿性,大分子有機物以及氮磷指標含量較低,不至于出現(xiàn)富營養(yǎng)化狀態(tài),但可溶性鹽離子含量較高,這可能與其地理位置靠近入海口有關(guān).

表2 地表水物理化學(xué)指標

2.2 表面活性劑對微生物的毒性作用

表面活性劑對微生物數(shù)量的影響結(jié)果如圖2所示.從圖2(a)(b)所示的平板菌落中可以直觀的看出,低濃度的表面活性劑作用下細菌量較多,而后隨著表面活性劑劑量的增加,菌量逐漸降低.為從統(tǒng)計學(xué)角度評估表面活性劑的作用強度,將生物量進行統(tǒng)計繪制如圖2(c)(d)所示柱狀圖,可以看出,兩種不同的表面活性劑分別對微生物表現(xiàn)出不同程度的影響,對于同一種表面活性劑,其對生物量的影響程度表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性.低濃度范圍內(nèi),微生物數(shù)量隨著表面活性劑濃度的升高而增加,并且在TCJ濃度為0.1g/L、KPS濃度為0.2g/L時分別出現(xiàn)生物量的最大值,與空白組數(shù)量相比分別增長5.09%和10.12%.此結(jié)果一方面說明水體中的微生物可以在含有表面活性劑的環(huán)境中生存,另一方面也表示,低濃度的表面活性劑對微生物基本無影響,甚至還可以在一定程度上刺激生物細胞系統(tǒng),起到促進的作用.Bautista等[26]指出,低濃度的表面活性劑可以作為碳源供微生物吸收利用,這也許是刺激微生物生長的又一重要因素.此后隨著表面活性劑濃度的繼續(xù)增加,這種促進作用減弱直至轉(zhuǎn)換為增殖抑制作用,并且TCJ的增殖抑制強度明顯高于同濃度下的KPS的抑制強度,這可能是由于細菌細胞膜上的磷脂層、革蘭氏陰性菌體膜上的脂多糖以及革蘭氏陽性菌的磷壁酸等結(jié)構(gòu)一般帶有負電荷,TCJ表面活性劑作為一種同時含有陰陽離子基團的兩性表面活性劑,與陰離子表面活性劑KPS相比更易通過靜電作用和疏水效應(yīng)與細菌表面接觸,正負電荷的結(jié)合打破了細胞的電位平衡狀態(tài),因而表現(xiàn)出更高的毒性作用[27-28].所以,針對不同的利用目的合理選擇濃度范圍對于充分發(fā)揮表面活性劑的綜合效益起著至關(guān)重要的作用.

圖2 微生物在不同濃度的TCJ和KPS下的平板照片及其生物量的變化

(a)和(c)分別為TCJ作用下的平板照片和生物量變化曲線,(b)和(d)分別為KPS作用下的平板照片和生物量變化曲線

圖3 表面活性劑對總蛋白質(zhì)含量的影響

圖3所示為表面活性劑對微生物蛋白質(zhì)含量的影響,可以看出,總蛋白含量的變化趨勢與細菌生物量基本一致,即在較低濃度的表面活性劑作用下,細菌總蛋白質(zhì)含量與對照組相比均有所增加.其中,在TCJ濃度為0.1g/L、KPS為0.2g/L時,其蛋白質(zhì)含量相對于空白組分別提高4.90%和15.04%,體現(xiàn)出一種超補償機制[29].但是隨著濃度提高,表面活性劑對細胞的脅迫作用增強,蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)負增長趨勢,在最高濃度1.5g/L的情況下,其蛋白質(zhì)含量較空白組降低約34%~43%.蛋白質(zhì)是胞內(nèi)各代謝反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),此結(jié)果表明高濃度表面活性劑的存在將會造成蛋白質(zhì)活性或結(jié)構(gòu)損傷,干擾細菌的正常生理功能.細胞膜的基本骨架是以磷脂和蛋白質(zhì)為主要成分的磷脂雙分子層,屬于一種含有疏水端和親水基的類磷脂型表面活性劑,由于兩者之間的相似性,外來表面活性劑分子可能會與膜蛋白形成復(fù)合體或者替換磷脂層,使細胞膜滲透性增強,胞內(nèi)小分子物質(zhì)外漏造成細菌死亡[30].

圖4 表面活性劑對微生物脫氫酶活性的影響

以TCJ和KPS為對象,測定其在不同濃度條件下對地表水中微生物脫氫酶活性的影響,結(jié)果如圖4所示.可以看出,在兩種不同的表面活性劑的作用下,脫氫酶活性的變化呈現(xiàn)相同的趨勢,即隨著表面活性劑濃度的升高,酶活性先增加后下降,最后在高劑量表面活性劑的作用下趨于平緩.不同點在于,對于TCJ,其酶活性最大值[63.7μg/(mL·h)]出現(xiàn)在表面活性劑0.1g/L的濃度下,此后隨著濃度的增大,脫氫酶活性迅速下降,最終降低量約為對照組的62.8%,呈現(xiàn)出顯著的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系.而在KPS的作用下,脫氫酶活性在達到最高值72.0 [μg/(mL·h)]后平緩下滑,但仍表現(xiàn)出較空白組高的活性含量,在最高表面活性劑濃度1.5g/L下降低約36%.這是因為酶活性與生物量并不是簡單的線性關(guān)系,而是受到培養(yǎng)環(huán)境的pH值、溫度、基質(zhì)底物以及激活劑等各種因素的影響.分析以上實驗結(jié)果可知,一定量的表面活性劑分子可以刺激細胞的感應(yīng)系統(tǒng),調(diào)節(jié)微生物代謝使之盡快適應(yīng)環(huán)境的改變,作為酶的“激活劑”誘導(dǎo)脫氫酶的合成,而當(dāng)表面活性劑的含量超過細菌的耐受限度后,微生物已無法通過自身的調(diào)節(jié)功能應(yīng)對外界毒物的脅迫,導(dǎo)致胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的有序性被破壞,酶活性代謝紊亂,繼而演變成為脫氫酶的“抑制劑”.

2.3 表面活性劑對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 樣品的α多樣性及測序質(zhì)量分析 高通量測序序列經(jīng)過精簡純化后,從3個樣品中共獲得123681條細菌有效序列,平均測序量約為41100~41300條.從門到屬各分類水平上對微生物類群進行統(tǒng)計,結(jié)果如表3所示,所有樣本的微生物有效序列可分別歸屬于9個門,16個綱,34個目,52個科和90個屬.通常,根據(jù)指示側(cè)重點的不同將α多樣性指數(shù)分為兩大類,著重體現(xiàn)微生物群落豐富度的Chao1估計量(Chao1)以及統(tǒng)籌兼顧群落均一性的香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)和辛普森(Simpson)指數(shù).一般而言,指數(shù)與群落的豐富度或者多樣性大致呈正比關(guān)系.從表3中可以看出,α多樣性指數(shù)的大小基本呈現(xiàn)出TCJ>空白>KPS的順序,說明TCJ作用下的水體中微生物豐度最高,TCJ在一定程度上刺激了某些微生物的生長繁殖,促使微生物向多樣性的方向發(fā)展;而此濃度下的KPS在生物量上并未造成顯著的影響,但卻能抑制部分微生物的繁殖.微生物樣品的Shannon和Simpson指數(shù)在TCJ作用下具有最大值,說明TCJ組的微生物多樣性較高[31].總體來看,3個樣品間的微生物組成仍存在一定的差異.另外,通過對3個樣本隨機抽取的序列繪制稀疏曲線(圖5)發(fā)現(xiàn),隨著測序深度的增加,曲線漸趨平緩,表明測序深度的繼續(xù)增加不再對微生物群落豐富度和多樣性造成顯著的影響,即此深度下的測序量可滿足后續(xù)的群落結(jié)構(gòu)分析的要求.

表3 細菌16S rRNA 序列及a多樣性指數(shù)

圖5 隨機抽取序列的稀釋性曲線

2.3.2 微生物在屬水平上的分析 運用QIIME軟件構(gòu)建樣本微生物在屬水平上的組成分布柱狀圖(圖6),可以看出,水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)較為單一,結(jié)合水樣采集時間及水質(zhì)監(jiān)測結(jié)果可以推測出,冬季氣溫較低、水體有機物含量少等都可能成為制約微生物多樣性的重要因素[32].其中,腸桿菌屬()在KPS作用下的微生物中相對豐度高達97.8%,在空白組和TCJ組中分別占有87.3%和75.0%,以較高的數(shù)量優(yōu)勢成為所有樣品中的優(yōu)勢菌群,這可能是由以下兩方面造成的:(1)腸桿菌屬作為一種分布極為廣泛的菌屬,其在原水樣中本身數(shù)量較多;(2)可能受到培養(yǎng)條件的影響[33],腸桿菌屬在擴大培養(yǎng)環(huán)境中具有較強的適應(yīng)能力,處于優(yōu)勢地位,因而相對豐度較高.此外,在空白組中相對豐度位于前列的還有假單胞菌屬(7.7%)、根瘤菌屬(2.1%)和不動桿菌屬(, 0.7%);KPS作用下的水體中除了腸桿菌屬這一絕對優(yōu)勢菌群外,不動桿菌屬以0.6%的比例成為相對豐度位居第二的菌群,其余菌屬的相對豐度均低于0.3%;而在TCJ作用下的樣品中,假單胞菌屬的相對豐度達到11.6%,寡養(yǎng)單胞菌()以10.1%的相對豐度成為此樣品中的又一優(yōu)勢菌屬.除此之外,不動桿菌屬的菌屬比例為1.2%,具有1%的相對豐度.對以上結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn),相同的表面活性劑濃度下,KPS可極大的促進的生長代謝,而且對其它菌屬(尤其是和)的抑制作用顯著;與對照組相比,此濃度的TCJ可使原水樣中的和的相對豐度分別下降12.3%和1.1%,以及的相對豐度分別提高9.7%和3.9%,進一步說明和對于TCJ表面活性劑較為敏感.

圖6 樣本在屬分類水平上的組成

2.3.3 群落OTU比較分析 將豐度值低于全樣本測序總量0.001%的OTU去除,對得到的有效OTU單元進行劃分和分類地位鑒定,結(jié)果如圖7(a)所示,可以看出,KPS的OTU分類單元明顯低于空白組和TCJ組.再通過R軟件對樣本中特有及共有的OTU豐度矩陣進行計算,得到圖7(b)所示的OTU分布韋恩(Venn)圖.從圖中可直觀看出,在97%的相似度閾值水平上3個樣本共產(chǎn)生474條OTU,囊括空白樣、TCJ和KPS中各包含的283、292和225條OTU信息,3個樣本間共有OTU為108個,分別占KPS、空白、TCJ組各自O(shè)TU數(shù)目以及所有樣品OTU總數(shù)的48%、38%、37%和22.8%.空白、TCJ 和KPS特有的OTU單元數(shù)分別為79、105和72個.盡管3個樣本的微生物來源于同一水體,但是在KPS和TCJ兩種表面活性劑的分別作用下,其中的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,體現(xiàn)出群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境之間的密切相關(guān)性.另外,KPS組中約有61.8%的OTU可以在原水樣中發(fā)現(xiàn),高于同評判標準下TCJ組與空白組的共有OTU比例(59.2%),間接表明TCJ對微生物群落結(jié)構(gòu)的改變程度大于KPS的作用程度.同時,3個樣品的未加權(quán)聚類分析(圖8)表明KPS與空白組的微生物構(gòu)成相似性高于TCJ與KPS、TCJ與空白之間的相似度,與OTU分析結(jié)果保持一致.

圖8 基于物種(科)分布的樣本聚類分析

2.4 表面活性劑對細菌的作用機理分析

2.4.1 表面活性劑對細菌生長曲線的影響 表面活性劑對和生長曲線的作用結(jié)果如圖9所示,可以看出,未受表面活性劑干擾的純種菌在培養(yǎng)期的前4h基本處于生長遲緩期,光濁度無明顯變化,4h~12h之間為細菌的對數(shù)生長期,12h后細菌數(shù)量基本處于動態(tài)平衡狀態(tài).觀察TCJ作用下的(a)和(c)發(fā)現(xiàn),其生長受到嚴重抑制,分別在10,14h內(nèi)均無明顯數(shù)量變化.同樣于KPS作用(b, d)下,兩種菌在16h內(nèi)均未出現(xiàn)濁度的變化.此結(jié)果表明表面活性劑對細菌可產(chǎn)生一定的毒害作用,使處于S-G2/M期的細菌數(shù)目明顯增多[34],延緩或抑制細菌進入對數(shù)生長期,從而造成高劑量的表面活性劑下細菌數(shù)目明顯降低[35].此外,對比TCJ和KPS的作用效果發(fā)現(xiàn),KPS在細菌的生長周期方面表現(xiàn)出更強的抑制作用.

2.4.2 表面活性劑對細菌細胞膜通透性的影響 圖10為表面活性劑作用和后的熒光顯色照片,從圖10(a)和(d)可以看出,不受表面活性劑干擾的和無熒光顯色,表明正常生長條件下的細菌細胞膜完整,生長狀態(tài)良好,PI染料無法進入活細胞內(nèi)部,因而背景為全黑模式.而添加TCJ(圖10b和e)和KPS(圖10c和f)表面活性劑后,顯微鏡視野中呈現(xiàn)紅色斑點,說明表面活性劑作用下細菌細胞膜的完整性受到破壞,通透性增加后PI染料分子方可進入受損細胞內(nèi)部與DNA相嵌,從而釋放出紅色熒光.可以看出,KPS作用下的細菌熒光強度稍弱于TCJ作用下的強度,整體上說明細胞膜在KPS體系中的破壞程度低于TCJ體系.

圖9 表面活性劑對大腸桿菌(a, b)和金黃色葡萄球菌(c, d)生長曲線的影響

2.4.3 表面活性劑對細菌形態(tài)的影響 為進一步探究表面活性劑對細菌的作用機制,利用掃描電鏡對其作用后的細菌形態(tài)進行觀察.從圖11(a)可以看出,正常情況下的細胞表面光滑,呈短桿狀結(jié)構(gòu),然而當(dāng)其受到TCJ(圖11b)和KPS(圖11c)表面活性劑干擾后,細胞變?yōu)楦砂T狀.對于,正常生長條件下細胞表面圓潤光滑,類葡萄球狀,當(dāng)其暴露于TCJ(圖11e)和KPS(圖11f)表面活性劑后,細胞表面變得粗糙且呈不規(guī)則形態(tài).對此可以推測出,表面活性劑通過靜電與疏水作用與細菌結(jié)合后,可造成其膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞.且相對于KPS,含有陰陽離子基團的TCJ與細菌之間的結(jié)合力度更大,因而破壞性更強.

對以上結(jié)果分析可得,TCJ和KPS對細菌的作用機制存在一些共性,即都會造成細菌生長停滯期的延長、細胞膜滲透性的增加以及細胞形態(tài)的改變.但兩種表面活性劑之間又存在一定的差異性,如對于TCJ而言,其對細菌的破壞力度大但抑制時間短于KPS,KPS對細菌破壞強度小但抑制時間長.總而言之,表面活性劑對細菌的毒性作用是各種機制綜合作用的結(jié)果.

圖10 表面活性劑作用后的E.coli和S.aureus的熒光照片

(a)空白組;(b) TCJ表面活性劑處理后的;(c) KPS表面活性劑處理后的;(d)空白組;(e) TCJ表面活性劑處理后的;(f) KPS表面活性劑處理后的

圖11 表面活性劑作用后的E.coli和S.aureus的SEM圖

(a)空白組;(b) TCJ表面活性劑處理后的;(c) KPS表面活性劑處理后的;(d)空白組;(e) TCJ表面活性劑處理后的;(f) KPS表面活性劑處理后的

3 結(jié)論

3.1 微生物的數(shù)量及代謝活性均隨著表面活性劑濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢.其中,當(dāng)TCJ濃度為0.1g/L時,其作用下的微生物數(shù)量、總蛋白質(zhì)含量及脫氫酶活性較空白組分別提高5.09%、4.90%和11.75%;在0.2g/L的KPS的作用下,其分別提高10.12%、15.04%和26.31%,表現(xiàn)出明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系.

3.2 對0.1g/L表面活性劑作用下的微生物群落結(jié)構(gòu)分析可得,KPS表面活性劑可有效提高的相對豐度,對和抑制作用顯著;而TCJ表面活性劑則可明顯提高和的相對豐度,而使和的豐度值進一步降低.

3.4 純種菌實驗表明,表面活性劑可通過延緩或抑制細菌進入對數(shù)生長期、增加細胞膜的通透性、破壞細胞形態(tài)等干擾細胞的正常代謝途徑使之活性降低甚至死亡.

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Toxic effects of surfactants on microorganisms in surface water.

CHE Yang-li1, WEI Xiao-fang2, ZHANG Zhou1, ZHONG Yao-yao1, ZHANG Qun2, LIU Fang1,3*, LIU Chun-shuang1,3

(1.College of Chemical Engineering, China University of Petroleum (East China), Qingdao 266580, China；2.PetroChina Research Institute of Petroleum Exploration & Development, State Key Laboratory of Enhanced Oil Recovery, Beijing 100083, China；3.State Key Laboratory of Petroleum Pollution Control, Beijing 102206, China)., 2019,39(12)：5301~5311

The effects of betaine and petroleum sulfonate surfactants on the quantity and metabolic activity of microorganisms in surface water were investigated in this study. In addition, we also analyzed the changes of microbial community structure before and after treatment with surfactants based on the high-throughput sequencing of the 16S rRNA gene of the flora. The results showed that the growth activities of microorganisms under the stress of these two surfactants all present the phenomenon of promotion in low concentration and inhibition in high concentration, showing obvious concentration dependence. Compared with the control group, the microbial biomass, protein content and dehydrogenase activity were significantly decreased in the presence of 1.5g/L surfactants, and microbial community showed higher biological toxicity with betaine surfactant than petroleum sulfonate at the same concentration. The analysis of flora diversity indicated that(with a ratio of more than 75%) was the dominant genus in all samples. From each group, petroleum sulfonate can effectively improve the relative abundance of, and exert a significant inhibitory effect onand. However, betaine can significantly increase the proportion ofand, and inhibit the reproduction ofand. Through the interaction between surfactant and pure bacteria, it was shown that surfactant could interfere with the normal physiological function of cells by disturbing the growth cycle of bacteria and destroying the structure of cell membrane, resulting in the reduction of its activity and even death.

betaine；petroleum sulfonate；surfactant；biological toxicity；community structure

X172

A

1000-6923(2019)12-5301-11

車陽麗(1994-),女,山東濰坊人,中國石油大學(xué)(華東)碩士研究生,主要從事水污染控制技術(shù)研究.發(fā)表論文3篇.

2019-05-06

國家科技重大專項子課題(2016ZX05040-003)

* 責(zé)任作者, 教授, liufangfw@163.com