Sakaguchia cladiensis對(duì)磺胺甲嘧啶/銅復(fù)合污染中抗生素的降解

曾潔儀,曾蘇杭,紀(jì)夢(mèng)鈿,檀 笑,韓偉江,,陳爍娜*

Sakaguchia cladiensis對(duì)磺胺甲嘧啶/銅復(fù)合污染中抗生素的降解

曾潔儀1,曾蘇杭1,紀(jì)夢(mèng)鈿1,檀 笑2,韓偉江1,2,陳爍娜1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,廣東 廣州 510642；2.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655)

以某畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤篩選分離到的一株對(duì)磺胺甲嘧啶(Sulfamethazine,SMZ)具有耐受性的酵母菌(,A5)為研究對(duì)象,開展生長(zhǎng)特性及其對(duì)SMZ-Cu2+復(fù)合污染中SMZ降解特性研究.結(jié)果表明,SMZ和Cu2+脅迫下,菌A5也能較好生長(zhǎng).降解性能研究顯示,菌A5在復(fù)合污染體系中反應(yīng)3d,SMZ去除率達(dá)37.3%,共存的Cu2+對(duì)SMZ降解具有促進(jìn)作用.當(dāng)投菌量為1g/L,溶液pH值為中性,菌A5對(duì)1mg/L SMZ的降解效果最佳.透射電鏡分析表明,SMZ和Cu2+共存時(shí),菌A5的細(xì)胞壁膜破損嚴(yán)重,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外流.

磺胺甲嘧啶；銅；復(fù)合污染；；微生物降解

磺胺類抗生素和重金屬銅常被用作飼料添加劑,用于畜禽疾病防治和促生長(zhǎng),但是大部分抗生素卻不能被機(jī)體完全吸收,約超過85%會(huì)以藥物原形或代謝物經(jīng)排泄物進(jìn)入環(huán)境[1-2],重金屬也不能被降解[3-5],從而在畜禽養(yǎng)殖區(qū)及周邊形成典型的抗生素/重金屬?gòu)?fù)合污染[6].長(zhǎng)期脅迫下,勢(shì)必會(huì)誘導(dǎo)多重抗性微生物出現(xiàn),進(jìn)而破壞微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性平衡,對(duì)生態(tài)環(huán)境造成更大危害.因此,開展環(huán)境中殘留抗生素/重金屬去除的研究至關(guān)重要.微生物是環(huán)境中污染物分解轉(zhuǎn)化的主要參與者,關(guān)系到污染物在環(huán)境中的歸趨.據(jù)報(bào)道,已有學(xué)者從環(huán)境中篩選到多種抗生素降解菌[7-11],主要包括有節(jié)桿菌屬[7]、細(xì)桿菌屬[8]、無色桿菌屬[9]、不動(dòng)桿菌屬[10]、假單胞菌屬[11]和紅球菌屬[12]等,大部分都屬于細(xì)菌[13].研究顯示,這些細(xì)菌可將SAs作為唯一碳源或共代謝基質(zhì)進(jìn)行分解,環(huán)境條件的改變,包括溫度[14]、酸堿度[14]、鹽度[15]、濁度[16]以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]等都會(huì)影響SAs的去除.Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn),外加維生素和氨基酸可以促進(jìn)降解磺胺甲噁唑(SMX),抗生素濃度影響其抑菌效果,因此SAs初始濃度越高,其降解率越低[19],但是也有相矛盾的研究報(bào)道[20-21].微生物和抗生素的類別也是影響降解的主要因素,例如紅球菌可以共代謝降解磺胺甲噁唑(SMX)和磺胺甲噻二唑(SMT),但是卻不能以單一SAs為碳源生長(zhǎng)[12].另外一種紅球菌,可以降解SMX,但是當(dāng)有其它微生物共存時(shí),卻失去降解能力[22].由此可見,抗生素降解是一個(gè)復(fù)雜的過程,盡管已經(jīng)取得一些研究進(jìn)展,但是還很不足,而且關(guān)于抗生素/重金屬?gòu)?fù)合污染條件下微生物降解的研究還鮮有報(bào)道.

鑒于此,本研究選取磺胺甲嘧啶(Sulfamethazine, SMZ)和銅(Cu2+)為研究對(duì)象,開展水體SMZ-Cu2+復(fù)合污染中SMZ微生物降解特性研究,以期為微生物技術(shù)在環(huán)境抗生素/重金屬?gòu)?fù)合污染治理中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(NB):蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏 3g,水1000mL, pH=7.2~7.4.LB培養(yǎng)基:NaCl 10g,酵母提取物5g,胰蛋白胨 10g,水 1000mL, pH=7.0~7.2.無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM):NaCl 0.5g,MgCl·6H2O 0.1g,KH2PO40.3g,K2HPO4·3H2O 0.3g,水1000mL, pH=7.0~7.2.上述培養(yǎng)基使用前均置于高壓蒸汽滅菌鍋,121℃,滅菌30min.固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%~2.0%的瓊脂粉,充分混合,滅菌后冷卻凝固而制成.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SMZ儲(chǔ)備液:稱取一定量SMZ (Ehrenstorfer GmbH,德國(guó))于棕色容量瓶中,用色譜純甲醇溶解定容,配制成100mg/L的SMZ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4℃冰箱,避光保存?zhèn)溆?Cu2+標(biāo)液:稱取一定量的Cu(NO3)2,用去離子水溶解定容,配制成Cu2+濃度為1000mg/L的溶液,用0.22μm微孔過濾器過濾后,置于4℃冰箱保存待用.磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7):NaCl 8.5g,NaHPO4·2H2O 2.2g, NaH2PO4·2H2O 0.4g,水1000mL, 121℃,滅菌30min, 4℃冰箱保存待 用.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SMZ耐受菌的篩選和分離 從珠三角某畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)采集土樣.稱取1g土樣,加入含10mg/L SMZ的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中150r/ min,30℃避光培養(yǎng)3d后,取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含20mg/L SMZ的新鮮營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3d.然后同樣操作進(jìn)行轉(zhuǎn)接,每次接種新培養(yǎng)體系中SMZ的濃度增加10mg/L.當(dāng)接種4次后,即SMZ濃度增至50mg/L時(shí),連續(xù)培養(yǎng)7d后,取培養(yǎng)液涂布在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上,于30℃恒溫培養(yǎng)箱,倒置避光培養(yǎng)1~2d.挑取單一菌落在新平板上劃線分離培養(yǎng),進(jìn)一步純化.最后,選取純化的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),分別考察其對(duì)SMZ的降解效果.

1.2.2 菌體擴(kuò)大培養(yǎng)和菌懸液的制備 刮取一環(huán)目標(biāo)菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中,置于振蕩培養(yǎng)箱,25℃,150r/min恒溫培養(yǎng)24~36h.取活化至對(duì)數(shù)期的菌培養(yǎng)液離心(6000r/min,25℃,6min),收集菌體,用無菌水洗滌2次(6000r/min,離心5min).最后用無菌水重懸,配成0.02g/mL的菌懸液待用.

1.2.3 菌A5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化的目標(biāo)菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中(接種量1%),于25℃, 150r/min恒溫振蕩培養(yǎng).總共設(shè)置3個(gè)不同培養(yǎng)體系,分別為(1)純營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng);(2)含20mg/L SMZ;(3)含有20mg/L SMZ和20mg/L Cu2+,分別于0.5,1,2,3,4,6, 8,10,12,24,36,48,72,96,120,144,168,192,216,240h取樣,用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在600nm的吸光值(OD600),繪制菌A5的生長(zhǎng)曲線.

1.2.4 復(fù)合污染中SMZ的微生物降解性能 在含有SMZ和Cu2+(10mg/L)的MSM體系中接種菌A5,以SMZ為唯一碳源,分別考察時(shí)間,投菌量,溶液pH值以及污染物初始濃度對(duì)菌A5降解SMZ的影響,設(shè)計(jì)條件如下:

(1)時(shí)間:設(shè)置單一SMZ和SMZ-Cu2+復(fù)合污染降解體系,分別于0.5,1,2,3,5,7,9d取樣,分析SMZ殘余濃度;

(2)投菌量:于復(fù)合污染降解體系,分別設(shè)置投菌量為0.5,1,1.5,2g/L;

(3)溶液pH值:于復(fù)合污染降解體系,分別調(diào)節(jié)溶液初始pH值為1~3(酸性),5~6(弱酸),7(中性),9~10(弱堿)和12~14(堿性)的復(fù)合污染降解體系;

(4)SMZ初始濃度:于復(fù)合污染降解體系,分別設(shè)置SMZ初始濃度為0.5,1,3,5mg/L;

除特殊說明,所有反應(yīng)體系溶液pH值為中性,SMZ濃度為1mg/L,Cu2+濃度為10mg/L,投菌量為1g/L,反應(yīng)條件為150r/min,25℃,作用48h.以不加菌體系作為空白對(duì)照,每組試樣做3個(gè)平行樣.

1.2.5 溶液中SMZ的分析 將樣品離心(6000r/ min,8min,25℃),取0.5mL上清液置于1.5mL離心管中,加入等體積的萃取液(0.1%甲酸:乙腈:甲醇=10:3: 1,//),旋渦振蕩至完全混合,之后10000r/min離心5min,上清液用0.22μm微孔過濾器過濾到棕色進(jìn)樣瓶,置于4℃保存,待測(cè).

溶液中SMZ用高效液相色譜儀(HPLC, LC- 20A,Shimadzu Japan)進(jìn)行分析.分析條件: C18反相柱(4.6×250mm,5μm,Thermo Fisher Scientific),柱溫30℃,流動(dòng)相為含0.1%甲酸的高純水:乙腈=30%: 70%(/),流速為1.000mL/min,進(jìn)樣量為20μL,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm.

1.2.6 菌A5細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)檢測(cè) 設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)條件:①不含污染物的MSM,作為空白對(duì)照;②含3mg/L SMZ的MSM;③含10mg/L Cu2+的MSM; ④含3mg/L SMZ和10mg/L Cu2+的MSM.所有培養(yǎng)體系接種菌A5,于25 ℃,150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72h,收集菌體,依次進(jìn)行固定,脫水,包埋處理,然后將其超薄切片染色后,用透射電鏡(TEM,TECNAI G212,FEI Holland)對(duì)菌A5的細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察.

2 結(jié)果與討論

2.1 SMZ降解菌的篩選與鑒定

經(jīng)過多次富集培養(yǎng)和篩選,從采集的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土樣中分離得到4株對(duì)SMZ具有較好耐受性的菌株,分別命名為A4,A5,A13和A14.對(duì)這4株耐受菌降解SMZ的能力進(jìn)行考察,結(jié)果如圖1所示.其中菌A5表現(xiàn)出較好的降解能力,反應(yīng)3d,其對(duì)SMZ的去除率最高,達(dá)38.2%,而菌A4的降解效果最不理想,在第3d時(shí)其對(duì)SMZ的降解率只有17.2%.另外,菌A13和A14的降解能力相近,作用3d對(duì)SMZ的去除率在25%~28%之間.因此選取降解效果較好的菌A5作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)菌株,并委托廣東省微生物所對(duì)其進(jìn)行鑒定.經(jīng)過DNA提取,PCR擴(kuò)增,26S rDNA序列測(cè)序及序列對(duì)比,鑒定菌A5與酵母菌同源性最高,達(dá)99.02%.

圖1 耐受菌降解SMZ能力對(duì)比

2.2 菌A5的生長(zhǎng)特性

分別在營(yíng)養(yǎng)體系(對(duì)照),單一SMZ和SMZ-Cu2+復(fù)合污染體系中,考察菌A5的生長(zhǎng)特性.如圖2所示,純營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)時(shí),菌A5經(jīng)過12h的生長(zhǎng)延遲期,之后開始快速生長(zhǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,直到第36h,菌A5生長(zhǎng)和死亡速率處于平衡,進(jìn)入較長(zhǎng)的生長(zhǎng)穩(wěn)定期,最后,隨著體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,菌體死亡速率超過生長(zhǎng)速率,在第168h之后,菌A5逐漸進(jìn)入衰亡期.此外,從圖上可以看出,在單一SMZ和SMZ-Cu2+復(fù)合污染的培養(yǎng)體系中,菌A5仍正常生長(zhǎng).但是當(dāng)培養(yǎng)液中含有單一SMZ時(shí),到達(dá)穩(wěn)定期,菌A5生物量(即OD600)明顯較少,而同時(shí)含有SMZ和Cu2+的培養(yǎng)體系,菌A5的生物量卻跟對(duì)照組基本一致.這說明SMZ對(duì)菌A5的生長(zhǎng)是有一定抑制作用,但當(dāng)有Cu2+共存時(shí),兩者產(chǎn)生交叉抗性,Cu2+增強(qiáng)了菌A5對(duì)SMZ的抗性,進(jìn)而影響SMZ的抑菌效果[23-24].

圖2 不同培養(yǎng)體系中菌A5的生長(zhǎng)曲線

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雖然SMZ和Cu2+存在對(duì)菌A5生長(zhǎng)影響不顯著,但是延遲了菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間,從12h延緩至24h.這說明菌A5對(duì)體系中存在的污染物具有生長(zhǎng)適應(yīng)期,需要通過延遲期對(duì)自身代謝調(diào)整來重新適應(yīng)和響應(yīng)外環(huán)境不利條件的脅迫.除此,研究還發(fā)現(xiàn),在含有SMZ和Cu2+的培養(yǎng)體系中,菌A5直到第250h仍沒有進(jìn)入衰亡期,而是一直保持穩(wěn)定的持續(xù)生長(zhǎng).這是因?yàn)橐坏┚鶤5適應(yīng)了新環(huán)境,并且在生長(zhǎng)過程中受著污染物的持續(xù)馴化,到生長(zhǎng)后期,即使體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,但是被馴化的菌A5仍可以利用污染物SMZ作為碳源和能源物質(zhì)來維持生長(zhǎng)[25],因此,跟無添加污染物的培養(yǎng)體系相比,其衰亡期推遲. Chen等[26]在研究苯并[a]芘(BaP)的微生物降解時(shí)也發(fā)現(xiàn),在BaP存在的培養(yǎng)體系中,可以二次生長(zhǎng),同樣推遲進(jìn)入衰亡期.另一方面,Cu2+作為多種細(xì)胞酶激活劑,可以誘導(dǎo)菌A5分泌和激活更多細(xì)胞酶,促使體系中有害物質(zhì)的代謝分解,從而提高菌體適應(yīng)性[27-28].由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體生命力旺盛,代謝活躍,因此在之后的實(shí)驗(yàn)中,選取培養(yǎng)12~24h的菌A5開展一系列SMZ降解性能研究.

2.3 SMZ降解隨時(shí)間變化

分別考察菌A5在單一和復(fù)合污染體系中對(duì)SMZ降解隨時(shí)間的變化,結(jié)果如圖3所示.隨時(shí)間推移,菌A5對(duì)SMZ的降解率逐漸增大,但是由于污染物不同,SMZ降解率增長(zhǎng)的情況也不一樣.當(dāng)體系中只含有SMZ時(shí),菌A5在前3d對(duì)SMZ的去除率只有10%左右,之后隨時(shí)間快速增長(zhǎng),到第5d基本穩(wěn)定,保持在37.0%.而在SMZ-Cu2+復(fù)合污染體系中,菌A5對(duì)SMZ的去除率從第12h開始就隨時(shí)間持續(xù)上升,到第3d達(dá)到最大值,為37.3%,之后基本保持穩(wěn)定.

圖3 SMZ去除率隨時(shí)間變化

從結(jié)果顯示,菌A5降解SMZ經(jīng)歷了遲緩期,再到快速降解,之后趨于穩(wěn)定,可見菌體在反應(yīng)初始對(duì)外源污染物需要一個(gè)適應(yīng)過程,在這階段SMZ去除率較低.之后,在SMZ不斷誘導(dǎo)應(yīng)激下,而且體系速效碳源和氮源的缺乏,致使菌A5分泌細(xì)胞酶將SMZ作為碳源和氮源分解利用,因此SMZ去除率快速增長(zhǎng),但是隨著時(shí)間延長(zhǎng),菌體代謝物不斷積累,此時(shí)菌A5會(huì)優(yōu)先利用更容易分解的代謝物以及SMZ分解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)作為能源,所以SMZ的去除被停滯.大部分金屬離子是微生物生長(zhǎng)代謝的重要輔助因子,是多種酶的重要激活劑,可協(xié)助催化細(xì)胞代謝中的氧化等反應(yīng).佟瑤等[29]就研究證實(shí),部分金屬離子在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)可以作為酶激活劑促進(jìn)三苯基錫的酶促降解.因此,當(dāng)體系同時(shí)含有Cu2+時(shí),菌A5對(duì)SMZ的降解幾乎不需經(jīng)歷遲緩期,那是因?yàn)殂~離子作為多種細(xì)胞酶激酶,可以有效激活菌A5各種細(xì)胞降解酶,進(jìn)而將SMZ快速分解利用.

2.4 投菌量對(duì)SMZ降解的影響

改變投菌量,考察復(fù)合污染情況下,不同生物量對(duì)菌A5降解SMZ的影響,結(jié)果如圖4所示.當(dāng)投菌量為1g/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ的降解效果最佳,作用48h, SMZ的去除率可達(dá)33.3%,而當(dāng)投菌量分別為0.5,1.5,2g/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ的去除率差別不顯著,在15.7%~17.1%之間.

從結(jié)果顯示,投菌量并非越大越好.當(dāng)投菌量由0.5g/L增加到1.0g/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ的去除率顯著增大,但當(dāng)投菌量繼續(xù)增加(>1.0g/L)時(shí),菌A5對(duì)SMZ的降解效果反而下降.這是因?yàn)镾MZ具有一定的抑菌毒性,當(dāng)生物量較小時(shí),單位質(zhì)量菌體承受的毒害作用大,菌體的生長(zhǎng)受到抑制,進(jìn)而影響其對(duì)SMZ的降解.而如果投菌量持續(xù)增大,雖然菌體抵抗SMZ脅迫的能力增強(qiáng),可以正常生長(zhǎng),但是由于MSM體系中SMZ是唯一的碳源和氮源,隨著生物量增大,有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)勢(shì)必會(huì)成為菌體生長(zhǎng)的制約因素,隨著一些菌體的死亡,其細(xì)胞分解并作為存活下來菌A5利用的能源物質(zhì),因此抑制了菌A5對(duì)SMZ的分解利用.通過本實(shí)驗(yàn)證實(shí),當(dāng)投菌量為1g/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ的降解效果最好,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)定投菌量為1g/L.

圖4 投菌量對(duì)SMZ降解的影響

2.5 溶液pH值對(duì)SMZ降解的影響

環(huán)境pH值是微生物活性的敏感因子,微生物的生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝都與環(huán)境pH值密切相關(guān)[30-31].同時(shí),環(huán)境pH值的改變也會(huì)影響某些污染物的化學(xué)形態(tài)和性質(zhì)[32].本實(shí)驗(yàn)通過改變?nèi)芤旱某跏紁H值,研究不同酸堿度對(duì)菌A5降解SMZ的影響,結(jié)果如圖5所示.菌A5對(duì)溶液pH值的變化表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性,均能在一定程度去除SMZ,但是不同酸堿度對(duì)菌A5降解SMZ的影響還是較顯著,中性條件(pH =7)下更有利于菌A5對(duì)SMZ的去除,作用48h去除率達(dá)39.9%.

圖5 不同溶液pH值對(duì)SMZ去除的影響

溶液pH值對(duì)SMZ降解的影響主要表現(xiàn)在兩方面:一是影響SMZ的水解途徑;二是影響微生物生長(zhǎng)代謝以及相關(guān)酶的合成及活性[26].磺胺類抗生素在中性條件下水解較慢,活性較低[33],但結(jié)果顯示中性條件SMZ的去除率最佳,可見此時(shí)溶液中SMZ以微生物去除為主.從圖5還可以看出,堿性條件下,菌A5對(duì)SMZ仍有較好去除效果,這是因?yàn)榫鶤5生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌大量的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物,調(diào)節(jié)了溶液的pH值,使反應(yīng)體系趨向中性或弱堿性,從而有利于菌A5對(duì)SMZ的去除.而當(dāng)溶液過酸時(shí)(pH￡3),會(huì)導(dǎo)致H+濃度超過酶的適應(yīng)范圍,引起細(xì)胞膜電荷變化,進(jìn)而影響菌的代謝活性.張珈瑜等[34]研究J2對(duì)磺胺二甲基嘧啶降解特性時(shí)發(fā)現(xiàn),初始pH=6.0~8.0時(shí),較適宜磺胺二甲基嘧啶的微生物降解,這與本研究結(jié)果相似.另外,也有研究表明,溶液酸堿度不同會(huì)影響SMZ的化學(xué)形態(tài).當(dāng)溶液為酸性或堿性時(shí),SMZ主要以陽離子或陰離子形態(tài)存在,只有當(dāng)溶液為中性時(shí),SMZ則以非解離狀態(tài)存在,而不同形態(tài)的SMZ會(huì)影響其與微生物之間的相互作用[35-36].

2.6 初始濃度對(duì)SMZ微生物降解的影響

圖6顯示的是 SMZ 初始濃度分別為0.5,1.0, 3.0,5.0mg/L 時(shí),菌A5作用48h, 復(fù)合污染中SMZ的去除情況.結(jié)果表明,菌A5對(duì)不同濃度的SMZ均有一定的降解效果.當(dāng)SMZ的初始濃度為1mg/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ去除率最好,達(dá)38.2%.而隨著SMZ濃度的增加,菌A5對(duì)其去除率呈下降趨勢(shì),這是因?yàn)镾MZ濃度越大,其對(duì)微生物的抑菌毒性越強(qiáng),不利于微生物生長(zhǎng),抑制菌體的代謝活性[19].另一方面,如果SMZ濃度過低,菌體與SMZ接觸的量以及SMZ的傳質(zhì)會(huì)受到限制,這在一定程度會(huì)阻礙SMZ的微生物降解.

圖6 菌A5對(duì)不同濃度SMZ的降解

2.7 SMZ/Cu2+脅迫下菌A5細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化

分別收集單一SMZ,單一Cu2+,以及SMZ-Cu2+復(fù)合污染處理了3d的菌A5細(xì)胞,并以營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的菌體為對(duì)照,利用TEM觀察在不同污染物脅迫下,菌A5細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化.

從圖7(A)可以看出,對(duì)照組的菌A5生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞呈橢圓形,菌體內(nèi)充盈原生質(zhì)體,液泡和核區(qū)清晰可見,甚至觀察到細(xì)胞出芽生殖.圖7(B)是單一SMZ處理的菌A5細(xì)胞,可見少數(shù)細(xì)胞仍可進(jìn)行出芽生殖,但有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞,細(xì)胞內(nèi)陷甚至破裂.相比SMZ的影響,單一Cu2+處理的菌A5細(xì)胞形態(tài)正常(見圖7(C)),保持較好的橢圓形,但細(xì)胞邊緣有一圈明顯的白色亮部,可推測(cè)在Cu2+影響下,菌A5細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離;而且在細(xì)胞壁表面黏附了很多細(xì)微顆粒物,可能是溶液中Cu2+被吸附到細(xì)胞表面.圖7(D)顯示的是SMZ-Cu2+復(fù)合污染處理的菌A5,可見細(xì)胞破損嚴(yán)重,細(xì)胞形狀扭曲變形,部分細(xì)胞原生質(zhì)大量流失.由此可見,抗生素SMZ對(duì)菌體細(xì)胞的影響較明顯,尤其是復(fù)合污染.但是即使菌體細(xì)胞發(fā)生變形破損,仍可以對(duì)SMZ進(jìn)行降解,這是因?yàn)榧?xì)胞中發(fā)揮作用的降解酶仍沒有全部流失,從而保證了細(xì)胞的代謝活性;也有可能雖然胞內(nèi)酶隨著細(xì)胞破裂流出,但是仍能保持活性,對(duì)溶液中的SMZ發(fā)揮降解作用.

圖7 不同處理?xiàng)l件下的菌A5細(xì)胞TEM圖

(A)對(duì)照組;(B)單一SMZ處理;(C)單一Cu2+處理;(D) SMZ-Cu2+復(fù)合污染處理

3 結(jié)論

3.1 從某畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤篩選分離到1株SMZ降解菌,經(jīng)鑒定為酵母菌,命名為A5.污染物SMZ和SMZ-Cu2+復(fù)合污染的存在,菌A5仍能保持正常生長(zhǎng),但是其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延遲,同時(shí)也推遲進(jìn)入衰亡期.

3.2 SMZ-Cu2+復(fù)合污染中,菌A5作用3d,對(duì)SMZ的去除率達(dá)37.3%,Cu2+的存在可以促進(jìn)菌A5對(duì)SMZ的降解.投菌量,溶液pH值,SMZ初始濃度均會(huì)對(duì)菌A5降解SMZ產(chǎn)生影響.當(dāng)投菌量為1g/L, pH值為中性,SMZ初始濃度為1mg/L時(shí),菌A5對(duì)SMZ降解效果最佳.

3.3 TEM分析表明,相比Cu2+,SMZ對(duì)菌體細(xì)胞的影響更顯著,尤其在SMZ-Cu2+復(fù)合污染脅迫下,菌A5細(xì)胞破損嚴(yán)重,細(xì)胞形狀扭曲變形,部分細(xì)胞質(zhì)流失.

[1] Liu J L, Wong M H. Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs): A review on environmental contamination in China [J]. Environment International, 2013,59:208-224.

[2] Radke M, Lauwigi C, Heinkele G, et al. Fate of the antibiotic sulfamethoxazole and its two major human metabolites in a water sediment test [J]. Environmental Science & Technology, 2009,43(9): 3135-3141.

[3] 張家泉,田 倩,許大毛,等.大冶湖表層水和沉積物中重金屬污染特征與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) [J]. 環(huán)境科學(xué), 2017,38(6):2355-2363. Zhang J Q, Tian Q, Xu D M, et al. Pollution characteristics and risk assessment of heavy metals in water and sediment from daye lake [J].Environmental Science, 2017,38(6):2355-2363.

[4] 張博文,趙甲亭,吳二威,等.滏陽河河流水體中重金屬污染特征及其對(duì)青?；【托鄙鷸旁宓亩拘孕?yīng) [J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2018,13(1): 179-189.Zhang B W, Zhao J T, Wu E W, et al. Water pollution characteristics of heavy metals in Fuyang River system and their toxicity tosp. Q67and[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2018,13(1):179-189.

[5] Chen C Q, Zheng L, Zhou J L, et al. Persistence and risk of antibiotic residues and antibiotic resistance genes in major mariculture sites in Southeast China [J]. Science of Total Environment, 2017,580:1175– 1184.

[6] Hu Y A, Cheng H F, Tao S. Environmental and human health challenges of industrial livestock and poultry farming in China and their mitigation [J]. Environment International, 2017,107:111-130.

[7] Deng Y, Mao Y P, Li B, et al. Aerobic degradation of sulfadiazine byspp.: kinetics, pathways, and genomic characterization [J]. Environmental Science & Technology, 2016,50(17):9566-9575.

[8] Topp E, Chapman R, Devers-Lamrani M, et al. Accelerated biodegradation of veterinary antibiotics in agricultural soil following long-term exposure, and isolation of a sulfamethazine-degradingsp. [J]. Journal of Environmental Quality, 2013,42(1): 173-178.

[9] Reis P J M, Reis A C, Ricken B, et al. Biodegradation of sulfamethoxazole and other sulfonamides byPR1 [J]. Journal of Hazardous Materials, 2014,280: 741-749.

[10] Yang C W, Hsiao W C, Chang B V. Biodegradation of sulfonamide antibiotics in sludge [J]. Chemosphere, 2016,150:559-565.

[11] Jiang B C, Li A, Cui D, et al. Biodegradation and metabolic pathway of sulfamethoxazole byHA-4, a newly isolated cold-adapted sulfamethoxazole-degrading bacterium [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014,98(10):4671-4681.

[12] Gauthier H, Yargeau V, Cooper D G. Biodegradation of pharmaceuticals byandby co-metabolism [J]. Science of the Total Environment, 2010,408: 1701-1706.

[13] Chen J F, Xie S G. Overview of sulfonamide biodegradation and the relevant pathways and microorganisms [J]. Science of the Total Environment, 2018,640-641:1465-1477.

[14] Zheng T, Cai L, Xu B T, et al. Sulfadiazine biodegradation by: Mechanism and degradation product identi?cation [J]. Chemosphere, 2019,237:124418.

[15] Yang C C, Huang C L, Cheng T C, et al. Inhibitory effect of salinity on the photocatalytic degradation of three sulfonamide antibiotics [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2015,102:116-125.

[16] Nguyen P Y, Carvalho G, Reis A C, et al. Impact of biogenic substrates on sulfamethoxazole biodegradation kinetics bystrain PR1 [J]. Biodegradation, 2017,28:205-217.

[17] Liang D H, Hu Y Y. Simultaneous sulfamethoxazole biodegradation and nitrogen conversion bysp. JL9 using with di?erent carbon and nitrogen sources [J]. Bioresource Technology, 2019,293:122061.

[18] Zhang Y B, Zhou J, Xu Q M, et al. Exogenous cofactors for the improvement of bioremoval and biotransformation of sulfamethoxazole by[J]. Science of the Total Environment, 2016,565:547-556.

[19] Mao F, Liu X H, Wu K, et al. Biodegradation of sulfonamides byMR-1 andsp. strain MR-4 [J]. Biodegradation, 2018,29:129-140.

[20] Lin B, Lyu J L, Lyu X J, et al. Characterization of cefalexin degradation capabilities of twostrains isolated from activated sludge [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015,282:158- 164.

[21] Selvi A, Salam J A, Das N. Biodegradation of cefdinir by a novel yeast strain,sp. SMN03isolated from pharmaceutical wastewater [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014,30: 2839-2850.

[22] Larcher S, Yargeau V. Biodegradation of sulfamethoxazole by individual and mixed bacteria [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011,91:211-218.

[23] 劉愛菊,劉 敏,李夢(mèng)紅,等.Cu,抗生素協(xié)同污染對(duì)土壤微生物活性的影響 [J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2013,22(11):1825-1829. Liu A J, Liu M, Li M H, et al. Collaborative effects of Cu and antibiotic on soil microbial activities [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2013,22(11):1825-1829.

[24] 傅海霞,劉 怡,董志英,等.抗生素與重金屬?gòu)?fù)合污染的生態(tài)毒理效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境工程, 2016,34(4):60-63+104. Fu H X, Liu Y, Dong Z Y, et al.Progress in research on ecological toxicity of combined pollution of antibiotics and heavy metals [J]. Environmental Engineering, 2016,34(4):60-63+104.

[25] Ni B J, Zeng R J, Fang F,et al. Fractionating soluble microbial products in the activated sludge process [J]. Water Research, 2010, 44(7):2292-2302.

[26] Chen S N, Yin H, Ye J S, et al. Effect of copper(II) on biodegradation of benzo[a]pyrene by[J]. Chemosphere, 2013,90(6):1811-1820.

[27] 王 瑞,魏源送.畜禽糞便中殘留四環(huán)素類抗生素和重金屬的污染特征及其控制[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,32(9):1705-1719. Wang R, Wei Y S. Pollution and control of tetracyclines and heavy metals residues in animal manure [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013,32(9):1705-1719.

[28] Steffen K T, Hatakka A, Hofrichter M. Degradation of benzo[a]pyrene by the litter-decomposing basidiomycete: role of manganese peroxidase [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(7):3957-3964.

[29] 佟 瑤,葉錦韶,尹 華,等.金屬離子對(duì)三苯基錫酶促降解的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2011,32(3):779-783. Tong Y, Ye J S, Yin H, et al.Effect of heavy metal ions on triphenyltin enzymatic degradation [J]. Environmental Science, 2011, 32(3):779-783.

[30] 鄭 蕾,田 禹,孫德智.pH值對(duì)活性污泥胞外聚合物分子結(jié)構(gòu)和表面特征影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2007,28(7):1507-1511. Zheng L, Tian Y, Sun D Z. Effects of pH on the surface characteristics and molecular structure of extracellular polymeric substances from activated sludge [J]. Environmental Science, 2007,28(7):1507-1511.

[31] 劉春光,金相燦,孫 凌,等.pH值對(duì)淡水藻類生長(zhǎng)和種類變化的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2005,24(2):294-298. Liu C G, Jin X C, Sun L, et al. Effects of pH on growth and species changes of algae in freshwater [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2005,24(2):294-298.

[32] 廖 敏,黃昌勇,謝正苗.pH值對(duì)鎘在土水系統(tǒng)中的遷移和形態(tài)的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 1999,19(1):83-88. Liao M, Huang C Y, Xie Z M. Effect of pH on transport and transformation of cadmium in soil-water system [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 1999,19(1):83-88.

[33] 王 冉,劉鐵錚,王 恬.抗生素在環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸及其生態(tài)毒性[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2006,26(1):265-270. Wang Y, Liu T Z, Wang T.The fate of antibiotics in environment and its ecotoxicology: A review [J]. Acta Ecologica Sinica, 2006,26(1): 265-270.

[34] 張珈瑜,彭星星,賈曉珊.磺胺二甲基嘧啶(SM2)高效降解菌J2的分離篩選及降解特性研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2019,39(9):2919-2927. Zhang J Y, Peng X X, Jia X S. Isolation and characterization of high efficiency sulfamethazine-degrading bacterium strain J2 [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2019,39(9):2919-2927.

[35] Gao J, Pedersen J A. Adsorption of sulfonamide antimicrobial agents to clay minerals [J]. Environmental Science and Technology, 2005, 39(24):9509-9516.

[36] Pan L J, Tang X D, Li C X, et al. Biodegradation of sulfamethazine by an isolated thermophile-sp. S-07 [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2017,33(5):85.

Biodegradation of Sulfamethazine in Sulfamethazine/Copper combined pollution by.

ZENG Jie-yi1, ZENG Su-hang1, JI Meng-tian1, TAN Xiao2, HAN Wei-jiang1,2, CHEN Shuo-na1*

(1.College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；2.South China Institute of Environmental Science, Ministry of Ecology and Environment, Guangzhou 510655, China)., 2019,39(12)：5293~5300

To understand the characteristics of sulfamethazine (SMZ) biodegradation in the polluted environment where SMZ and Cu2+co-existed, this study focused on the bio-treatment of SMZ-Cu2+in different conditions by(named A5), a strain resistant to sulfamethazine, which was screened and isolated from the soil of a livestock and poultry farm (Guangzhou, China). The results showed that, with the presence of single SMZ or SMZ-Cu2+combined pollution in the culture medium, strain A5 still maintained a good growth trend.was an effective strain to remove SMZ from pollution system. The presence of Cu2+was beneficial for A5 to decompose SMZ. The degradation rates of SMZ reached 37.3% in 3d. Under the condition of 1g/L of inoculum, 1mg/L initial concentration of SMZ, and neutral pH, the removal effect of strain A5 on SMZ was the best. The transmission electron microscope (TEM) analysis showed that the cells of strain A5 were severely damaged when SMZ and Cu2+co-existed in solution, leading to the outflow of cytoplasm.

sulfamethazine；copper ions；combined pollution；；biodegradation

X172

A

1000-6923(2019)12-5293-08

曾潔儀(1997-),女,廣東茂名人,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生,主要從事環(huán)境污染微生物修復(fù)研究.發(fā)表論文2篇.

2019-05-10

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030313062,2018A030310203);廣州市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(201804010208)

* 責(zé)任作者, 講師,chenshuona@scau.edu.cn