白菊米多糖大孔樹脂脫色工藝研究

沈 錦，劉鈺梅，李 潔，潘依雯，彭小羽，陳艷麗

(鹽城師范學院 藥學院，江蘇 鹽城 224007)

白菊(White Chrysanthemum.)屬菊科，多年生草本，又名甘菊、杭白菊、茶菊。白菊米是小白菊含苞待放的花蕾經(jīng)科學方法加工而成，外形似半粒綠豆大，黃綠色輕圓微扁。白菊具有養(yǎng)肝明目、清心補腎、健脾和胃、潤喉生津等功效[1]。藥理研究表明，菊花活性成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、降血脂等生物活性[2]。但目前對菊花化學成分的研究多集中在萜類、黃酮類、酚類等小分子化合物，對菊花多糖等大分子活性物質(zhì)研究鮮有報道[3]。

傳統(tǒng)提取工藝獲得的粗多糖往往含有雜蛋白、色素等雜質(zhì)，進一步純化前需將這些雜質(zhì)去除，提高多糖純度。目前常用的多糖脫色方法有活性炭法、雙氧水法、大孔樹脂脫色法等[4-5]，每種脫色方法都有各自特點。

本文以多糖脫色率和保留率為評價指標，采用單因素和正交實驗方法，優(yōu)選出白菊米多糖最佳脫色工藝并進行大量制備。為白菊米多糖的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菊米，產(chǎn)自江蘇射陽；D3520、AB-8、DM-13、D101大孔樹脂、732#強酸型陽離子交換樹脂，葡萄糖、半乳糖醛酸，牛血清白蛋白標準品；無水乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚等均為分析純。

扣壓搖擺式小型粉碎機，循環(huán)水真空泵，高速臺式離心機，恒溫水浴鍋，紫外-可見分光光度計，移液器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 白菊米多糖的制備

將粉碎白菊米以料液比1∶30的比例加入無水乙醇，90℃回流脫脂2 h。脫脂后以料液比1∶30的比例加入去離子水，80℃水浴提取2.5 h，抽濾后濾渣在相同條件下二次提取并抽濾。合并兩次提取濾液濃縮至200 mL，以1∶4的體積比加入無水乙醇，置入冰箱過夜。抽濾后分別以無水乙醇、丙酮洗滌脫水，60℃干燥得白菊米粗多糖。

1.2.2 脫色評價指標[6]

取1.2.1項下白菊米粗多糖，加去離子水溶解配制成5 mg/mL濃度，在200～750 nm范圍內(nèi)進行紫外-可見光全波長掃描。結(jié)果顯示，多糖溶液在450 nm處有最大吸光度，故確定此波長為色素最大吸收波長。

(1) 脫色率的測定：取1 mL白菊米多糖溶液，加水稀釋至5 mL，混勻后在450 nm處測定吸光度值，計算脫色率。

脫色率(%)=A脫色后/A脫色前× 100%

(2) 多糖保留率測定：以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法[7]測定白菊米多糖含量。

多糖保留率(%)=M脫色前-M脫色后/M脫色前×100%

1.2.3 樹脂預處理

采用95%乙醇浸泡大孔樹脂24 h后，乙醇洗至無色，水洗至不再有乙醇味。732#陽離子樹脂用蒸餾水浸泡24 h，水洗至溶液澄清，過濾后用1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h，水洗至pH值到7.0左右，過濾后再用1 mol/L HCl溶液24 h浸泡，水洗至pH值達到7.0左右。

1.2.4 樹脂選擇

分別稱取經(jīng)預處理后的D3520、AB-8、DM-130、D101和732#強酸型陽離子樹脂各12 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL白菊米多糖溶液，25℃下恒溫振蕩24 h。結(jié)束后靜置取上清液2 mL，進行白菊米多糖脫色率和多糖保留率測定。

1.2.5 樹脂脫色工藝單因素考察

1.2.5.1 樹脂用量對脫色率、多糖保留率的影響

固定脫色溫度50℃，脫色時間2 h，分別取3、6、9、12、15、18 g大孔樹脂于具塞錐形瓶中，加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振蕩脫色，計算多糖脫色率和保留率，繪制樹脂用量對多糖脫色率和保留率曲線。

1.2.5.2 時間對脫色率、多糖保留率的影響

固定樹脂用量12 g，脫色溫度50℃，分別設(shè)置脫色時間0.5、1、2、3、4、5 h。在具塞錐形瓶中加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振蕩脫色，計算多糖脫色率和保留率，繪制脫色時間對多糖脫色率和保留率曲線。

1.2.5.3 溫度對脫色率、多糖保留率的影響

固定樹脂用量12 g，脫色時間2 h，分別設(shè)置脫色溫度20、30、40、50、60、70℃。在具塞錐形瓶中加入5 mg/mL白菊米多糖溶液30 mL，振蕩脫色，計算脫色率和多糖保留率，繪制脫色溫度對多糖脫色率和保留率曲線。

1.2.6 白菊米多糖脫色正交試驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，對樹脂用量、脫色時間、脫色溫度進行3因素3水平的L9(3)3正交實驗設(shè)計[8]，實驗因素水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.7 驗證性實驗

以正交實驗結(jié)果中的最佳脫色工藝，平行實驗測定3次，計算脫色率和多糖保留率。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫色樹脂篩選

五種不同型號樹脂脫色結(jié)果見表2。D101大孔樹脂脫色中，白菊米多糖保留率達64.48%，脫色率達51.41%，與其他樹脂相比，脫色率較高且對多糖保留率的影響較小。因此選擇其進行進一步脫色工藝優(yōu)化。

表2 五種不同型號樹脂脫色率、多糖保留率結(jié)果

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 樹脂用量對脫色率、多糖保留率的影響

圖1所示，隨著樹脂用量的增加，多糖脫色率逐漸增加，但多糖保留率在降至60%左右時基本保持不變。當樹脂用量為12 g/100 mL多糖溶液時，多糖脫色率為40.69%，多糖保留率為62.21%。繼續(xù)增加樹脂用量，多糖脫色率增加不大，綜合考慮選擇12 g/100 mL樹脂用量作為本實驗最佳樹脂量。

圖1 樹脂用量對多糖脫色率和保留率的影響

2.2.2 時間對脫色率、多糖保留率的影響

由圖2可知，隨脫色時間增加，多糖保留率先增后減，脫色率呈上升趨勢。當脫色時間為2 h時，多糖保留率為68.66%，此時脫色率為45.66%。在2 h之前，脫色時間過短導致脫色率不高，而2 h之后，脫色率增加并不明顯但多糖保留率呈明顯下降趨勢，故選擇2 h為最佳脫色時間。

圖2 脫色時間對多糖脫色率和保留率的影響

2.2.3 溫度對脫色率、多糖保留率的影響

從圖3可知，多糖脫色率隨時間的延長呈下降趨勢，多糖保留率受溫度影響變化不大。當脫色溫度為30℃時，脫色率為44.98%，多糖保留率為60.25%，溫度繼續(xù)升高，脫色率明顯下降，可能高溫影響樹脂結(jié)構(gòu)使脫色率下降。綜合考慮，選擇30℃為最佳脫色溫度。

圖3 脫色溫度對多糖脫色率和保留率的影響

2.3 正交實驗結(jié)果分析

以脫色率和多糖保留率為考察指標，對白菊米多糖脫色樹脂用量、脫色時間和脫色溫度進行3因素3水平的 L9(3)3正交實驗設(shè)計(表1)。從表3實驗結(jié)果可知，3個因素對實驗結(jié)果的影響順序分別為 A > B > C，即脫色樹脂用量>脫色時間>脫色溫度，在實驗考察范圍內(nèi)，最優(yōu)組合為A1B2C2，即樹脂用量9 g/100mL多糖溶液，脫色時間2 h，脫色溫度30℃時脫色效果和多糖保留率綜合為最佳。從表4方差分析可知，樹脂用量對實驗結(jié)果有顯著性影響(P < 0.05)。在此最優(yōu)工藝條件下，對白菊米多糖大孔樹脂脫色進行3次重復驗證性實驗，得到多糖脫色率為45.72%，多糖保留率為64.28%。

表3 大孔樹脂脫色正交實驗結(jié)果分析

表4 大孔樹脂脫色正交實驗方差分析

3 結(jié)論

本文通過單因素和正交實驗設(shè)計，對白菊米多糖大孔樹脂脫色工藝進行優(yōu)化。得到最佳脫色工藝為：D101大孔樹脂用量9 g/100mL多糖溶液，脫色時間2 h，脫色溫度30℃。在此工藝條件下對白菊米多糖進行脫色，計算得到脫色率為45.72%，多糖保留率為64.28%，脫色后白菊米顏色明顯變淺。白菊米多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性還需進一步研究，該實驗為白菊米多糖的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。