動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜法制備高純度芍藥苷

羅霖筠，王 磊，饒桂維*

(1.浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015;2.杭州師范大學(xué) 錢(qián)江學(xué)院理工分院，浙江 杭州 310018)

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的干根，白芍中的主要有效成分之一是白芍總苷，其中芍藥苷占白芍總苷的90%以上，是白芍主要活性成分[1]。芍藥苷是一種單萜類(lèi)糖苷化合物，最早于1963 年從毛茛科植物芍藥中提取[2]。具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的作用[3]。此外，《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)將芍藥苷的含量作為白芍的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。大量現(xiàn)代藥理研究表明，芍藥苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)和補(bǔ)血等藥理作用，其藥用價(jià)值日益受到重視[4-12]。芍藥苷的提取分離方法有很多研究報(bào)道，包括水煎煮法、回流法、超聲提取法和微波提取法等傳統(tǒng)方法。陳赟[13]使用水煎煮法以40%乙醇為提取溶劑，80℃提取，2 h/次，芍藥苷提取率為35.4%。水煎煮法可以節(jié)約成本，但是由于原料中化合物組成復(fù)雜，在加熱過(guò)程中會(huì)提取出其他水溶性物質(zhì)，降低后續(xù)提純效率。黃夏敏等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，白芍傳統(tǒng)水煎煮工藝中，芍藥苷損失率高達(dá)40%以上，受熱破壞是從白芍中提取芍藥苷生產(chǎn)工藝中含量下降的主要原因，因此，工藝過(guò)程中應(yīng)避免長(zhǎng)期高溫受熱?；亓魈崛》ǎ炙庈蘸拷档碗S著回流時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，因此長(zhǎng)時(shí)間的提取和加熱會(huì)導(dǎo)致活性成分的破壞。陳建平等[15]采用超聲波輔助技術(shù)提取白芍中芍藥苷，提取條件為：料液比為1∶15(g/mL)，超聲溫度為60℃，超聲時(shí)間為20 min，乙醇濃度為60%，超聲功率為75 W，提取率為0.296%。超聲提取法乙醇用量大，回收周期長(zhǎng)，提高了芍藥苷的提取成本，由于工藝復(fù)雜、生產(chǎn)設(shè)備成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。黃天輝等[16]優(yōu)化了微波輔助提取白芍中芍藥苷的方法，最佳優(yōu)化條件為微波功率850 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶12、提取時(shí)間25 min。該方法不僅提取時(shí)間短、效率高，平行性好，而且節(jié)省了提取時(shí)間和溶劑，為其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考；但也存在生產(chǎn)儀器成本高的問(wèn)題。

然而，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對(duì)天然產(chǎn)物、生物制藥、中草藥等領(lǐng)域的深入研究，人們對(duì)精華物質(zhì)的質(zhì)量的需求越來(lái)越高，傳統(tǒng)的制備技術(shù)已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需求，需要更低成本，更高效率的替代技術(shù)。

動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)(Dynamic axial compression,DAC)是工業(yè)色譜中最常用、最容易實(shí)現(xiàn)的、效果更為理想的制備色譜裝填技術(shù)。柱內(nèi)填充勻漿填料及加壓活塞，在裝填和使用過(guò)程中始終保持填料柱床壓縮狀態(tài)以確保其均勻無(wú)空隙，可有效避免色譜柱空隙的形成，確保色譜柱的穩(wěn)定性良好。DAC作為一種新型的制備色譜技術(shù)，因其柱效高，重復(fù)性好、分離效率高、制備量大等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，制備色譜在中草藥有效成分的分離制備、天然植物的提取[20-21]、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的分離及制備色譜法分離純化合成藥物[24]等方面取得了許多成果。高明哲等[18]用工業(yè)制備高效液相色譜，通過(guò)兩步分離從積雪草中分離制備積雪草甙和羥基積雪草甙2種對(duì)照品，采用C18柱(50 mm×200 mm，5μm)，甲醇-水(60∶40)洗脫，20 min實(shí)現(xiàn)這兩種成分的分離及制備，產(chǎn)品純度均達(dá)到98%以上，實(shí)現(xiàn)了快速高效且高純度產(chǎn)物制備。陳文娟等[19]采用MCI柱層析法提取牛耳，半制備型高效液相色譜法分離制備了五種苯乙醇苷類(lèi)單體。使用外標(biāo)法對(duì)所得五種單體進(jìn)行了定量分析，其純度均在98%以上。田娜等[22]從經(jīng)乙醇處理的荷葉提取出Fr-1組分，在反向C1810 μm制備柱上用乙睛-水線性梯度洗脫，從荷葉中分離得到金絲桃苷、異槲皮苷和紫云英，三種化合物的純度都均在97%以上，其中首次從荷葉中分離得到紫云英。Sakuma等[23]采用大型反向動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱從三形科植物紅柴胡中分離出了3種皂苷成分saikosaponins a.c和d，采用三步梯度法得到了3種的皂苷的純組分，產(chǎn)物收率90%以上，各單體皂苷中的雜質(zhì)含量均小于1%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芍(購(gòu)自藥店)，芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自阿拉丁)，MCI聚苯乙烯聚合物凝膠(日本三菱)。甲醇為色譜純(TEDIA 天地試劑公司)，乙醇為分析純(杭州青辰化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

福立FL2200液相色譜系統(tǒng)，包括二元泵、紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器；FDU-1200立式冷凍干燥 日本理化公司；LC6000工業(yè)化制備液相系統(tǒng) 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；MS205DU 電子天平(METTLER TOLEDO)；RV10 digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，包括真空泵； UPWS超純水器 杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

在芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品及純度檢測(cè)分析條件為室溫30℃，色譜柱為室溫，流動(dòng)相為甲醇-水(體積比：65∶35)，進(jìn)樣體積為10 μL。體積流量1.0 mL/min；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

1.3.2 樣品含量測(cè)定與計(jì)算

將制備好的樣品用甲醇溶解，進(jìn)行液相色譜分析，采用外標(biāo)法，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中各組分芍藥苷含量。采用Excel 2010、SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.3.3 芍藥苷粗品的制備

取白芍粉末5.0 g，用2倍量90%乙醇提取，收集提取后洗脫液，減壓濃縮，真空冷凍干燥，得芍藥苷粗品5.18 g備用。

1.3.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

1.3.5 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取1.3.3下粉末100 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加甲醇使之溶解，定容至50 mL容量瓶中，標(biāo)記為“標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液”，置于4℃冰箱備用。分別取2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。配置得0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.7 線性放大

線性放大原理是基于不同色譜系統(tǒng)的恒定化學(xué)性質(zhì)和傳質(zhì)過(guò)程的等線性放大。線性放大不僅是簡(jiǎn)單的放大分析，還需考慮色譜柱大小、進(jìn)樣體積、填料性質(zhì)、流速、進(jìn)樣量、產(chǎn)品純度、回收率等。線性放大系數(shù)計(jì)算公式如式所示：

其中X為線性放大系數(shù)，L1為放大前色譜柱長(zhǎng)度，L2為放大后分析柱的半徑；r1為放大前的制備柱半徑。r2為放大后色譜柱長(zhǎng)。

1.3.8 色譜分離條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)所用分析柱為HypersiL ODS2 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；半制備柱為SunFire C18OBD Prep Column,10 μm,19 mm×250 mm；動(dòng)態(tài)軸向制備柱內(nèi)徑為50 mm，裝填料為Daisogel C18,10 μm，裝填高度為500 mm。

在分析柱上建立了芍藥苷樣品及純度檢測(cè)方法。通過(guò)有機(jī)相考察及超載研究，確定合適制備方法的分析型色譜方法。根據(jù)線性放大理論，完成從芍藥中提取高純度芍藥苷分析、半制備、制備逐級(jí)放大。并對(duì)樣品進(jìn)行定性、峰面積歸一化純度檢測(cè)。

芍藥苷制備分析條件為：室溫下30℃，色譜柱溫度為室溫，流動(dòng)相為甲醇-水溶液體積比(體積比：65∶35),流速為118.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 MCI柱色譜洗脫劑的篩選

取MCI聚苯乙烯聚合物凝膠18 g，取“1.3.3”項(xiàng)下的提取液5 mL上樣，平行3份進(jìn)行樣品吸附后，洗脫體積與樹(shù)脂質(zhì)量比為2∶1。分別用 40%、60%、80%、90%乙醇溶液36 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，HPLC法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算芍藥苷含量及洗脫率，結(jié)果見(jiàn)表1～4。實(shí)驗(yàn)表明90%乙醇作為洗脫溶劑洗脫率最高。

表1 40%乙醇對(duì)芍藥苷洗脫影響

表2 60%乙醇對(duì)芍藥苷洗脫影響

表3 80%乙醇對(duì)芍藥苷洗脫影響

表4 90%乙醇對(duì)芍藥苷洗脫影響

2.1.2 分析柱濃度超載

實(shí)驗(yàn)條件如1.3.1所述，在保證相同進(jìn)樣體積的前提下，選取不同濃度進(jìn)樣，分別以因素變化考察其對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)中選擇進(jìn)樣體積10 μL，樣品濃度分別為2、10、20、30、100 mg/mL對(duì)芍藥苷粗品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同樣品濃度分離疊加圖

Fig.1 The HPLC chromatograms of different concentrations

從圖1結(jié)果可知，隨著進(jìn)樣濃度的增加，相應(yīng)的峰面積也在增加中，在2到30 mg/mL時(shí)差異不大，當(dāng)進(jìn)100 mg/mL時(shí)，目標(biāo)物峰高變高明顯。

2.1.3 分析柱體積超載

實(shí)驗(yàn)條件如1.3.1所述，在保證相同進(jìn)樣濃度的前提下，選取不同體積進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)中選擇進(jìn)樣濃度為100 mg/mL，進(jìn)樣體積分別為1、3、5、10、20 μL芍藥苷粗品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同樣品體積分離疊加圖

Fig.2 The HPLC chromatograms of different volumes

從圖 2結(jié)果可知，隨著進(jìn)樣體積的增加，目標(biāo)峰高也增加，1、3、5、10 μL時(shí)上升變化不大，在進(jìn)樣體積達(dá)到20 μL時(shí)，變化明顯。

由上述兩個(gè)超載試驗(yàn)，最終確定適合制備放大的分析型色譜條件為：室溫下，色譜柱為(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇：水(體積比為65∶35)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL進(jìn)樣濃度為100 mg/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.1.4 線性放大

超載實(shí)驗(yàn)最終選定了分析型系統(tǒng)上的最佳分析型分離條件為：進(jìn)樣濃度為100 mg/mL，進(jìn)樣體積為20 μL，流速為1.0 mL/min。根據(jù)線性放大理論結(jié)合1.3.7線性放大公式得到半制備及制備型系統(tǒng)上的理論條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 分析、半制備和制備的分離條件

2.1.5 半制備及工業(yè)色譜分離芍藥苷

采用半制備柱為SunFire C18OBD Prep Column，10 μm，19 mm×250 mm進(jìn)行半制備芍藥苷。將1.3.3項(xiàng)下芍藥苷粗品用甲醇溶解后進(jìn)樣，體積流量為17 mL/min；進(jìn)樣體積2 mL，收集11.5 min時(shí)間流分，濃縮至干。

采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱(50 mm×500 mm)，裝填Daisogel C18,10 μm填料，制備純化芍藥苷。將1.3.3項(xiàng)下芍藥苷粗品用甲醇溶解后進(jìn)樣，體積流量為118 mL/min；進(jìn)樣體積5 mL。收集12.5 min時(shí)間點(diǎn)洗脫的流分，濃縮干燥，得到淡黃褐色粉末。半制備型分離及制備型分離色譜圖如圖3、4所示。

圖3 芍藥苷半制備分離

Fig.3 Semi-preparation separation of paronifiorin extracts

圖4 芍藥苷制備分離

2.1.6 收集組份芍藥苷純度測(cè)定

分別取芍藥苷對(duì)照溶液和供試品10 μL，在“1.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，使用外標(biāo)法計(jì)算出經(jīng)動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜制備芍藥苷的含量為96.14%。

2.2 線性關(guān)系考察

在1.3.1色譜條件下，分別對(duì)配制好的不同濃度的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2120.2X-230.96,R2=0.993，芍藥苷在0.1130～1.010 mg/mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從分析(ID 4.6 mm)、半制備(ID 19 mm)到制備(ID 50 mm)逐步放大，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)組分的分離純化，收集芍藥目標(biāo)組分經(jīng)HPLC峰面積歸一化法得到。

考慮到大規(guī)模制備的成本和分離效果，本實(shí)驗(yàn)以白芍為原料，經(jīng)提取、濃縮、冷凍干燥后，采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜快速分離制備芍藥苷。

芍藥苷為白芍中的活性成分，但在白芍中的含量并不高，因此，其標(biāo)準(zhǔn)品昂貴，直接用于研究其藥理活性和藥效的成本較高。在本實(shí)驗(yàn)中，建立了一種快速制備高純度芍藥苷的方法，所得化合物的純度達(dá)96.14%。