急性創(chuàng)傷性完全性脊髓損傷患者腸道菌群多樣性研究

張潔，李建軍，張超，楊德剛，楊明亮，杜良杰，高峰，申敏鑫

1.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市 100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫(yī)院脊柱脊髓神經功能重建科，北京市 100068；3.北京腦重大疾病研究院神經損傷與修復研究所，北京市 100068；4.北京市神經損傷與康復重點實驗室，北京市 100068

急性脊髓損傷(acute spinal cord injury,ASCI)是一種常見的嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)生率、高死亡率、高致殘率和高耗費性的特點[1-3]。這些患者的早期存活率已經顯著提高，但他們的生活質量仍然不能令人滿意。在ASCI 患者面臨的問題中，神經源性腸道功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NBD)是一個重大的生理和心理問題，會嚴重影響患者的生活質量[4-5]。

人類腸道由數(shù)以千計不同的細菌物種定居，它們的數(shù)量和遺傳含量分別是宿主的1倍和150倍[6]。細菌對于正常消化、營養(yǎng)吸收以及細胞的發(fā)育、新陳代謝和功能都至關重要[7-8]。腸道菌群失調的常見原因包括抗生素使用、長期應激和胃腸功能障礙。大多數(shù)急性完全性脊髓損傷患者的腸道通過時間改變，腸黏膜功能減弱，導致腸道中的菌群移位。抗生素的使用也會影響腸道微生態(tài)系統(tǒng)[9-10]。因此，腸道菌群失調可能發(fā)生在脊髓損傷患者中。

本研究對急性創(chuàng)傷性完全性脊髓損傷患者和健康人的腸道微生物進行比較，探討腸道微生物與血清生物標志物之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年5 月至2018 年5 月在北京博愛醫(yī)院住院治療的創(chuàng)傷性完全性脊髓損傷患者，符合美國脊柱損傷協(xié)會(American Spinal Injury Association,ASIA)殘損分級的診斷標準[11]。

患者組納入標準：①完全性脊髓損傷(脊髓損傷ASIA 殘損分級A 級)；②患者受傷時間為6 個月內；③年齡18～60 歲；④創(chuàng)傷性胸段脊髓損傷?；颊呓M排除標準：①無法完成問卷調查；②入組前1 個月內抗生素或益生菌使用史；③高血壓、糖尿病等慢性疾病病史；④肝炎、結核等傳染病和免疫代謝疾病病史；⑤酗酒史。

對照組納入標準：①年齡18～60歲；②醫(yī)院護工、陪護患者的家屬及醫(yī)院的醫(yī)生、護士。

共77 例受試者入組，其中對照組33 例，患者組44 例。對照組中男性17 例，女性16 例，平均(39.8±8.7)歲?；颊呓M男性36 例，女性8 例，平均(43.5±9.3)歲；T1～T4損傷21 例，T5～T12損傷23 例；受傷原因中車禍占40.9%，高處墜落占36.3%，重物砸傷占20.5%，擠壓受傷占2.3%；大部分患者(33 例)排便方式為利用甘油灌腸劑，其次為手指刺激肛門或擠壓、按摩腹部；20 例患者每天排便，其余每周2～6 次；34例患者排便時間0～30 min，10 例排便30～60 min；12例排便時會有伴隨癥狀，其中3例排便時會伴隨頭痛，9 例出汗，其余32 例沒有伴隨癥狀；NBD 評分為(8.23±4.4)分。

兩組年齡無顯著性差異(P>0.05)。見表1。本研究經中國康復研究中心倫理委員會批準(No.CRRCIEC-RP-SQ-006-01)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

收集受試者的臨床數(shù)據(jù)和新鮮糞便標本。在提取糞便基因組DNA 后，擴增16S rDNA 的V3-V4 區(qū)域，并使用Illumina MiSeq 平臺分析和比較兩組腸道微生物群。使用最新版本的國際脊髓損傷腸功能基礎數(shù)據(jù)集收集所有患者的腸功能核心數(shù)據(jù)[12-13]。

1.2.1 樣本收集

1.2.1.1 大便采樣

共收集77份新鮮大便標本，將糞便封裝后置于液氮罐中，送至實驗室。轉移并保持在-80 ℃的冷凍箱中進行冷凍保存。

1.2.1.2 血液及尿液采樣

77 例受試者中有27 例患者和23 例對照者提供了血液標本及尿液標本。血液標本分析丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、尿素(UREA)、葡萄糖(glucose,GLU)、肌酐(creatinine,CR)、尿酸(uric acid,UA)、總膽固醇(total cholesterol,Tch)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein,LDL)。尿液標本分析尿液中白細胞(urinary infection,UI)。

1.2.2 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒(美國OMEGA BIOTEK 公司)說明書進行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量；用338F(5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和806R(5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3')引物對V3～V4 可變區(qū)進行PCR擴增。

擴增程序：95 ℃預變性2 min，25 個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延 伸5 min(PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型)。擴增體系20 μl，5×FastPfu 緩沖液4 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，5 μmol/L 引物0.8 μl，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μl；DNA模板10 ng[14]。

1.2.3 Illumina Miseq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用Axy-Prep DNA Gel Extraction Kit(美國AXYGEN BIOSCIENCES 公司)進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

利用QuantiFluor?-ST(美國PROMEGA 公司)進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(美國ILLUMINA公司)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300 的文庫。利用Miseq PE300 平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控，使用FLASH 軟件進行拼接：①設置50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于50 bp 的序列；②barcode 需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；③根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp；去除無法拼接的序列。

使用的UPARSE軟件(Version 7.1)，根據(jù)97%相似度對序列進行OTU(Operational Taxonomic Units,操作分類單位)聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。

利用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設置比對閾值為70%[15]。

1.3 生物信息學

使用QIIME 1.9.0 處理測序讀數(shù)。使用Wilcoxon秩和檢驗來鑒定不同標記，使用LDA 對LEfSe分析中的每個特征進行評分?；?7%的序列相似性，用QIIME計算α多樣性指數(shù)。

通過unweighted-uniFrac 或binary-jaccard 方法測量β 多樣性。進行分層聚類，并使用Spearman 等級相關系數(shù)作為距離度量和在R 統(tǒng)計包中開發(fā)的定制腳本生成熱圖。

使用Metagenomic Profiles 統(tǒng)計分析軟件包(版本2.1.3)進一步分析輸出文件[16]。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 23.0 數(shù)據(jù)分析程序和Metagenomic Profiles 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。對于連續(xù)變量，應用獨立的t檢驗、Welcht檢驗、Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗。顯著性水平α雙側=0.05。

2 結果

2.1 生化指標

患者組GLU、UA、TG、Tch、LDL 和UI 均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組生化指標對比

2.2 生物學信息

2.2.1 α多樣性

共得到3 904 587 個序列。經過抽平后共識別了794個OTU。OTU 的Good覆蓋率為99.9%。與對照組比較，患者組菌群覆蓋率(coverage 指數(shù))在OTU 水平(P=0.041)(圖1A)和屬水平降低(P=0.019)(圖1D)，在屬水平，患者組代表群落豐富度的sob 指數(shù)(P=0.011)(圖1B)和ace指數(shù)(P=0.018)增高(圖1C)。

2.2.2 β多樣性

在OTU 水平的主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(圖2A)和非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)(圖2B)及在屬水平的NMDS分析(圖2C)顯示，兩組間細菌群落組成存在顯著差異。相似性分析結果顯示，兩組組間差異顯著大于組內差異(adonis，R=0.40,P=0.001)(圖2D)。

圖1 兩組微生物α多樣性對比結果

圖2 兩組微生物β多樣性對比結果

2.2.3 兩組物種差異性

在門水平排名前10的物種中，在患者組和對照組中主要的物種是Firmicutes(厚壁菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)。與對照組比較，患者組Bacteroidetes(擬桿菌門)減少(P<0.05)；Actinobacteria(放線菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Synergistetes(互養(yǎng)菌門)、Saccharibacteria(螺旋體菌門)和Cyanobacteria(藍藻菌門)明顯增多(P<0.05)。見圖3A。

在排名前15 的屬種中，有10 個物種在組間存在顯著性差異(P<0.05)。在對照組中明顯增高的物種為Bacteroides(擬桿菌屬)、Faecalibacterium(糞桿菌屬)、[Eubacterium]_rectale_group(直腸真桿菌屬)、Megamonas(巨單胞菌屬)、Roseburia(羅氏菌屬)(P<0.05)。在患者組中明顯增高的菌群有Bifidobacterium(雙歧桿菌屬)、Escherichia-shigella(大腸桿菌志賀菌)、Blautia(布勞特氏菌屬)、[Eubacterium]-coprostanoligene 和Akkermansia(阿克曼菌屬)(P<0.05)。見圖3B。

圖3 兩組菌群物種差異性比較

2.2.4 腸道微生物和生化標志物關聯(lián)性

典型關聯(lián)分析(canonical correlation analysis,CCA)顯示，GLU(P=0.013,r2=0.2318)，LDL(P=0.047,r2=0.1185)顯著影響門水平的群落組成。在屬水平，GLU(P=0.001,r2=0.8204)、TG(P=0.028,r2=0.3831)和Tch(P=0.001,r2=0.3375)、LDL(P=0.001,r2=0.5053)、UI(P=0.02,r2=0.2006)顯著影響群落的組成。血清生物標志物GLU、LDL、TG 和Tch 與細菌群落結構有相關性(P<0.05)。

不同環(huán)境因素與兩組群落組成的相關熱圖分析表明，在前10 種門水平，F(xiàn)irmicutes 與年齡(AGE)呈負相關，與UA 呈正相關(P<0.05)；Bacteridetes 與UREA、LDL、TG、UI、GLU、AST、ALT 呈負相關(P<0.05)；Proteobacteria與TG呈正相關(P<0.05)。見圖4A。

總豐度水平前15的屬中，ALT與Faecalibacterium和[Eubacterium]_rectale_group 呈負相關(P<0.05)，與Subdoligranulum、Escherichia-Shigella、Blauti、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和 norank_f__Ruminococcaceae呈正相關(P<0.05)；AST 與Lachnoclostridium 呈負相關(P<0.05)，與Subdoligranulum、Blautia 和[Eubacterium]_coprostanoligenes_group呈正相關(P<0.05)；UREA 與Bacteroides、Faecalibacterium和Roseburia 呈負相關(P<0.05)，與Prevotella_9 呈正相關(P<0.05)；GLU 與Bacteroides、Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈負相關(P<0.05)，與 Escherichia-Shigella、Blautia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Bifidobacterium 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相關(P<0.05)；Cr與Dialister呈正相關(P<0.05)；TG與Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈負相關(P<0.05)，與Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相關(P<0.05)；Tch 與[Eubacterium]_rectale_group 和Dialister 呈負相關(P<0.05)，與Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相 關(P<0.05)；HDL 與norank_f__Ruminococcaceae呈負相關(P<0.05)；LDL 與[Eubacterium]_rectale_group 呈負相關(P<0.05)，與Subdoligranulum、Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae 呈正相關(P<0.05)；UI 與Bacteroides 和Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈負相關(P<0.05)，與 Escherichia-Shigella、Blautia和norank_f__Ruminococcaceae呈正相關(P<0.05)。如圖4B。

圖4 不同環(huán)境因子在門水平(A)和屬水平(B)對健康人和脊髓損傷群體群落組成的相關熱圖分析

3 討論

盡管有研究描述了腸道菌群與中樞神經系統(tǒng)疾病之間的關聯(lián)，但脊髓損傷患者在6 個月內的腸道微生物群特征尚未被描述過。本研究比較健康成人和受傷時間在6 個月內的脊髓損傷患者腸道菌群的組成，并探討其和生化指標的關聯(lián)。從CCA 結果來看，年齡對菌群分布沒有顯著影響。對照組的男女菌群多樣性沒有明顯的區(qū)別，結合相似性分析來判斷兩組之間的差異顯著大于組內的差異，可以認為年齡和性別對試驗結果沒有明顯影響。

急性期脊髓損傷受傷原因中，40.9%為車禍，36.3%為高處墜落，這與國內外其他的關于脊髓損傷的病因調查結果相符[1-3]。患者年齡段大部分分布在39～55 歲，81.8%為男性，這些患者大部分處于勞動的黃金期，更容易遭受諸如創(chuàng)傷等意外傷害。大部分脊髓損傷患者存在NBD，脊髓損傷患者主要排便方式為利用甘油灌腸劑，其次為手指刺激肛門或擠壓、按摩腹部。腸道菌群可能是幫助改善這一問題的潛在目標。

16S rRNA 測序觀察到的OTU 覆蓋率為99.9%，測序數(shù)據(jù)達到飽和，能夠覆蓋人類腸道菌群組群落的絕大部分物種?；颊呓M和對照組比較，coverage 指數(shù)降低，ace 指數(shù)、sob 指數(shù)增高，表明急性脊髓損傷后，患者腸道菌群的豐度增加，但覆蓋的菌群種類減少，可能與急性脊髓損傷后，機體的應激機制和代償機制有關。β 多樣性分析顯示，兩組間細菌群落組成存在顯著性差異。說明急性期脊髓損傷患者存在腸道菌群紊亂。

本研究中，健康成人糞便微生物群的主要成分Bacteroides(擬桿菌屬，即Bacteroidetes 的核心屬)在脊髓損傷患者中減少。一項動物實驗表明[17]，創(chuàng)傷性脊髓損傷可導致腸道菌群失調，可影響脊髓損傷患者的功能恢復，加重脊髓炎癥和損傷。在該研究中，對胸椎損傷的雌性小鼠的糞便進行16S rRNA 測序分析，結果表明脊髓損傷后Bacteroidales(擬桿菌目)的豐度降低，與本研究的結果相似。本研究兩個優(yōu)勢種是Firmicutes 和Bacteroidetes，也與此前研究相同[18-19]。與正常人相比，脊髓損傷患者Bacteroidetes菌群減少，Actinobacteria、Proteobacteria、Synergistetes、Saccharibacteria 和Cyanobacteria 增加，使得脊髓損傷患者的腸道菌群失調。我們推測Bacteroides 是對人體有益的菌種。Gungor等[10]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者產生丁酸鹽的菌落顯著少于正常人群。本研究中具有短鏈脂肪酸產生功能的[Eubacterium]-rectale-group、Faecalibacterium、Bacteroide 和Roseburia 菌群也減少。Bacteroides 限制腸道鼠傷寒沙門氏菌擴張和糞便脫落[20]。這種效應是由微生物通過代謝產物直接產生的。推測短鏈脂肪酸的共生細菌改變腸道環(huán)境并幫助腸道抵抗感染。分析患者的UI 發(fā)現(xiàn)，大部分患者UI都高于正常參考值。由于胸段完全性脊髓損傷患者膀胱感覺異常，尿中有感染時不會出現(xiàn)尿頻、尿急、尿痛等典型膀胱刺激癥狀，所以很多患者的下尿路感染無法被及時發(fā)現(xiàn)。因此在臨床工作中要定期查尿常規(guī)，檢測尿路感染情況。其次UI 含量與Bacteroides、Faecalibacterium、[Eubacterium]_rectale_group 這幾種在健康人中明顯富集的菌呈負相關，而與Escherichia-Shigella、Blautia、norank_f__Ruminococcaceae、Akkermansia這些在患者組中富集的菌呈正相關，說明腸道菌群的紊亂容易導致尿路感染。

綜上，脊髓損傷后腸道菌群的紊亂會增加感染的發(fā)生傾向，干預患者的菌群組成可能降低感染的發(fā)生率。有待進一步研究。

脊髓損傷患者的血生化指標和健康人之間存在差異?；颊呓M血糖水平較正常人高[21-24]。有研究表明[25]，胰島素耐受糖尿病患者Bifidobacterium、Subdoligranulum 降低，Prevotella 升高。本研究中患者組較對照組Bifidobacterium、Subdoligranulum 增多，Prevotella-9 減少，環(huán)境因子對群落組成的相關熱圖分析表明，血糖水平與Bifidobacterium、Subdoligranulum 呈正相關，與Prevotella-9 呈負相關，不過只與Bifidobacterium 具有顯著相關性。這提示在受傷時間較短的情況下(6個月內)，血糖水平的升高可能與胰島素耐受關系不大，更有可能是應激的結果。6 個月內脊髓損傷患者腸道內Bifidobacterium 豐度的增加是機體為適應疾病所做的調整[26]。有研究證實[27]，運動訓練如跑步機訓練、主動或機器人輔助訓練、有或無功能性電刺激輔助的地面訓練可以改善脊髓損傷患者的高血糖。這些訓練可以增加葡萄糖儲存的能力，使參與葡萄糖磷酸化(己糖激酶)和氧化(檸檬酸合成酶)的酶以及葡萄糖轉運蛋白增加。

脊髓損傷患者的血脂包括Tch、TG和LDL水平明顯高于對照組。脊髓損傷后脂代謝紊亂，容易出現(xiàn)高脂血癥，這與以往的研究結果相符[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，Escherichia-Shigella、Blautia、norank_f__Ruminococcaceae、[Ruminococcus]_torques_group、[Ruminococcus]_gnavus_group 這些屬水平的物種與TG、Tch 和LDL 呈正相關，[Eubacterium]_rectale_group、Faecalibacterium 與TG、Tch 和LDL 呈負相關。脊髓損傷后血脂變化的機制不明，有可能與運動減少及情緒和飲食改變等有關。有研究表明[29-30]，腸道菌群可以通過影響脂肪細胞因子基因的表達，影響宿主的免疫系統(tǒng)、內源性大麻素系統(tǒng)等而導致脂質代謝異常。

本研究結果表明，脊髓損傷后腸道菌群的紊亂，與血脂變化存在相關性，腸道菌群可能參與血脂的變化。這為干預脊髓損傷后代謝紊亂提供了新思路。

本研究還存在一定局限性。由于樣本量有限，沒有根據(jù)患者受傷時間進行分組比較，未能進一步分析脊髓損傷患者腸道菌群多樣性隨時間的變化規(guī)律。下一步計劃進行動物實驗和縱向人體研究，以確定腸道微生物和脊髓損傷NBD 之間的因果關系，明確腸道微生物在脊髓損傷發(fā)生發(fā)展中起的作用，有助于產生新的干預方法。