大孔樹脂分離純化毛蕊花糖苷的研究

蘇 婭 孔 征 霍仕霞 姜 萌 閆 明

1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥劑室，新疆烏魯木齊 830049

肉蓯蓉是列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticola Ma 或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight干燥肉質(zhì)莖，具有補腎陽、益精血等功效。至今，已從肉蓯蓉分離鑒定出苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、木質(zhì)素類等近百種化合物[1]。毛蕊花糖苷是苯乙醇苷類主要藥效成分之一，其抗衰老、提高記憶力、神經(jīng)保護等藥理作用已被證實[2-3]。課題組前期對其改善腦損傷、改善學習記憶障礙、抗氧化、保護神經(jīng)細胞等方面也進行了研究[4-9]。本文對毛蕊花糖苷進行了熱、動力學及分離純化研究，為后期大規(guī)模分離純化毛蕊花糖苷原料藥的制備工藝提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

日本島津高效液相色譜儀：LC-20AB 泵，SPDM20A 二極管陣列檢測器，CBM-20A 系統(tǒng)控制器，CTO-20A 柱溫箱，SIL-20A 自動進樣器；BDS HypersilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；SQP 電子天平（萬分之一，賽多利斯科學儀器有限公司）；SHZ-ZA水浴恒溫振蕩器（上海梅香儀器有限公司）；UPS-1-40L優(yōu)普系列超純水器（烏魯木齊潔新環(huán)保設備有限公司）。

1.2 試劑

毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201512，96.7%）；95%乙醇（梅河口市阜康酒精有限公司）；甲醇（色譜純）；甲酸（分析純）；去離子水（自制）。

1.3 材料

管花肉蓯蓉提取毛蕊花糖苷浸膏；層析柱；D101樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；國產(chǎn)HP-20樹脂（安徽三星科技有限公司）；三菱HP-20樹脂（北京英萊克科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件

流動相：甲醇-0.2%甲酸（40∶60）；色譜柱：C18色譜（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35℃；檢測波長：330 nm。

2.1.2 對照品儲備溶液的制備

精密稱取毛蕊花糖苷對照品21.2 mg，50%甲醇定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，即得毛蕊花糖苷對照品儲備液，備用。

2.1.3 線性關系考察

精密量取2 mL 毛蕊花糖苷對照品儲備液于10 mL容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度，得410 μg/mL 對照品溶液，逐級稀釋分別得到205.00、102.50、51.25、25.63、12.81、6.41、3.20 μg/mL 對照品系列溶液。以峰面積為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=21522X-4502.9，r=1，線性范圍為3.20～410 μg/mL，平均加樣回收率為99.61%，RSD 為1.80%。

2.2 純化工藝研究

2.2.1 供試品溶液的制備

取自制肉蓯蓉毛蕊花糖苷浸膏90 g 用去離子水溶解定容至2000 mL，過濾，得到供試品溶液（1.5 mg/mL），HPLC 檢測，采用外標一點法進行分析。

2.2.2 大孔樹脂的預處理

將大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，再用去離子水洗至流出液無白色渾濁且無醇味，備用[10-12]。

2.2.3 大孔樹脂型號的選擇

取毛蕊花糖苷浸膏，配置成濃度為1 mg/mL 的藥液。準確稱取國產(chǎn)HP20、三菱HP-20、D101大孔樹脂2 g，加入40 mL 的藥液，于恒溫水浴鍋振蕩器中振搖24 h（25℃，85 r/min），測定吸附后溶液中毛蕊花糖苷含量，計算吸附率（X1）；將吸附后樹脂用純水洗至流出液無色，再用95%乙醇40 mL 進行解吸，得到解吸率（X2）。X1（%）=（C0-C1）/C0；X2（%）=（C1-C2）/C1；式中C0為溶液的初始濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液的濃度；C2為解吸后溶液的濃度。國產(chǎn)HP-20樹脂與D101樹脂吸附及解吸性能均優(yōu)于三菱HP-20樹脂。從經(jīng)濟等多方面考慮，選擇D101樹脂進一步考察其對毛蕊花糖苷的吸附分離特性。見表1。

表1 不同型號樹脂對毛蕊花糖苷的吸附率和解吸率（%）

2.2.4 動力學研究

2.2.4.1 吸附動力學模型 吸附過程主要分為3個階段：液膜擴散階段、顆粒內(nèi)擴散階段、吸附反應階段[13-14]，采用3種模型進行擬合，顆粒內(nèi)擴散模型：Qt=kit0.5+C；準一級吸附動力學模型：ln（Qe-Qt）=-k1t+lnQe；準二級吸附動力學模型：t/qt=1/k2qe2+t/qe。式中：Qt為t時刻的吸附量；Qe 為吸附平衡時刻的吸附量，mg/g；ki為內(nèi)擴散速率常數(shù)，mg/（g·min0.5）；k1為一級吸附速率常數(shù)，1/min；k2為二級吸附速率常數(shù)，g/（mg·min）；C為常數(shù)。

2.2.4.2 靜態(tài)吸附動力學的考察 取預處理后樹脂10 g，加入100 mL，按“2.2.1”項下的管花肉蓯蓉供試品溶液，在不同溫度下（25、30、35、40℃）恒溫水浴振蕩24 h，每隔一段時間測定溶液中毛蕊花糖苷的含量并計算單位吸附量。隨著吸附時間的延長，大孔樹脂對肉蓯蓉毛蕊花糖苷的吸附量隨之增加。在初始階段吸附量增長較快，吸附4.5 h 后，靜態(tài)吸附基本達到平衡，最大吸附值為12.7096 mg/g。見圖1。

圖1 D101大孔樹脂對毛蕊花糖苷的靜態(tài)吸附動力學曲線

2.2.4.3 大孔樹脂吸附管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷動力學研究 根據(jù)上述結(jié)果，吸附過程在4.5 h 內(nèi)基本達到平衡，分別繪制0～4.5 h 內(nèi)Qt與t0.5、ln（Qe-Qt）與t、t/qt與t 的擬合曲線圖，見圖2。其準二級吸附動力學擬合曲線的相關系數(shù)R2＞0.9998，D101型大孔樹脂吸附管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷的過程更符合準二級吸附動力學模型，該吸附過程的吸附速率受化學吸附機制的控制。見表2～3。

圖2 顆粒內(nèi)擴散、準一級吸附、準二級吸附動力學擬合曲線

表2 動力學擬合參數(shù)

2.2.4.4 吸附反應活化能 本研究選擇準二級吸附動力學模型中的k2作為吸附反應速率，根據(jù)Arrhenius 方程：lnk=-Ea/（RT）+A，繪制lnk 對1/T 的擬合曲線：lnk=-5769.9/T+14.277，R2=0.9831，求得活化能Ea=47.97 kJ/mol。

2.2.5 熱力學研究

2.2.5.1 等溫吸附曲線 在不同溫度下（25、30、35、40℃），對管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷進行靜態(tài)吸附實驗，取樹脂10 g，共4份，加入100 mL 不同濃度的管花肉蓯蓉供試品溶液（含毛蕊花糖苷0.1、0.15、0.2、0.3 g），恒溫水浴鍋振蕩24 h，吸附平衡后計算平衡吸附量。不同溫度下，D101型大孔樹脂對毛蕊花糖苷的等溫吸附曲線。見圖3。為進一步了解該吸附過程的吸附規(guī)律，分別用Freundlich（F）、Langmuir（L）方程對其進行擬合[15]。L 方程：Ce/Qe=1/KQ0+Ce/Q0；F 方程：logQe=logk+1/nlogCe。式中：Ce為溶液的平衡濃度，mg/mL；Qe為平衡濃度為Ce時樹脂的吸附量，mg/g；K，Q0為L 方程參數(shù)；k，n 為F 方程參數(shù)。R2大于0.9932。見表4。

表3 回歸方程

圖3 D101大孔樹脂對毛蕊花糖苷的靜態(tài)吸附等溫線

2.2.5.2 吸附熱力學參數(shù)的計算 吸附焓變△H[15]：lnCe=-lnk0+△H/RT；吸附自由能△G：△G=-nRT；吸附熵變△S：△S=（△H-△G）/T。式中：R 為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T 為熱力學溫度；n 為吸附強度；k0為熱力學方程參數(shù)?！鱄、△G 為負值。見表5。

表4 熱力學參數(shù)

表5 靜態(tài)吸附熱力學參數(shù)

2.2.6 最大上樣量的考察

取管花肉蓯蓉供試品溶液通過層析柱，每0.3 BV收集一次流出液，測定毛蕊花糖苷質(zhì)量，以上樣柱體積為橫坐標，泄漏量為縱坐標，制作泄露曲線，考察樹脂的最大上樣量[16-18]。上樣體積為6 BV 時，毛蕊花糖苷的泄漏量開始突增。見圖4。

圖4 泄露曲線

2.2.7 上樣速度的考察

取供試品溶液6 BV，分別以流速1、2、3 BV/h 上樣吸附。隨著上樣速度的增加，毛蕊花糖苷泄漏量越來越大，泄露率分別為0.04%、0.39%、1.04%，3個流速泄露均較少，選擇2 BV/h 流速進行上樣。

2.2.8 水洗量的考察

上樣后用去離子水以3 BV/h 的速度洗脫除去水溶性雜質(zhì)及未吸附的毛蕊花糖苷，每1 BV 收集1次水洗液，測定毛蕊花糖苷含量，在水洗體積至第8 BV時毛蕊花糖苷含量變化較小，但在此時水洗脫液中依舊有顏色，故繼續(xù)洗脫至11 BV，毛蕊花糖苷含量基本不變且洗脫液澄清透明。

2.2.9 洗脫溶劑的考察

取水洗后柱子進行洗脫溶劑梯度洗脫，以10%乙醇-60%乙醇的順序以3 BV/h 的速度洗脫，每個梯度洗脫3 BV，分別測定其毛蕊花糖苷含量，考察不同乙醇濃度對洗脫效果的影響，選擇較優(yōu)洗脫方法。30%乙醇洗脫液純度最高。見表6。

表6 不同乙醇濃度洗脫的純度

2.2.10 洗脫劑用量

按“2.2.9”項下洗脫溶劑洗脫10 BV，每1 BV 接收1次洗脫液并測定毛蕊花糖苷含量，當洗脫至第10 BV 時，毛蕊花糖苷含量較低為0.0702 mg/mL。

2.2.11 工藝驗證

按上述優(yōu)化的工藝，以D101大孔樹脂進行驗證試驗，獲得的毛蕊花糖苷含量分別為25.10%、23.76%、24.24%，與原管花肉蓯蓉提取物浸膏中毛蕊花糖苷含量為3.33%相比較，毛蕊花糖苷含量有明顯提高。

3 討論

本研究通過篩選，確定了使用D101大孔樹脂分離純化毛蕊花糖苷的最佳工藝：上樣液濃度為1.5 mg/mL，最大上樣量為6 BV，上樣速度為2BV/h，依次用11 BV的純化水，10 BV 的30%乙醇進行洗脫。

在動力學研究中可知該吸附過程為化學吸附，是由吸附劑與吸附質(zhì)間的化學鍵作用力而引起的,吸附需要一定的活化能，有很強的選擇性?！鱄 為負值，說明該吸附為放熱過程，△G 為負值，表明反應為自發(fā)過程，該吸附可逆，△G 隨著溫度的升高而減小，說明升高溫度不利于提高肉蓯蓉毛蕊花糖苷的吸附量，△S 為負值，說明體系熵值減?。粺崃W研究中，D101樹脂吸附等溫線符合熱力學方程。隨著溫度的升高，D101對肉蓯蓉毛蕊花糖苷的吸附量越低，適當?shù)亟档蜏囟?，有利于吸附進行。發(fā)現(xiàn)兩種方程擬合效果都較好，說明該吸附過程為單分子吸附和多分子吸附共同作用，結(jié)合動力學結(jié)果，應是以單分子吸附為主的吸附過程。毛蕊花糖苷為肉蓯蓉中主要藥效成分之一，分離純化毛蕊花糖苷有重要意義。以往研究多為對苯乙醇苷這一類物質(zhì)的純化研究，且純度較高，而對毛蕊花糖苷的研究很少，故本文對其進行了純化工藝研究[19-20]。本研究確定的工藝簡便，能較好地純化管花肉蓯蓉毛蕊花糖苷，且D101大孔樹脂成本較低，可重復利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。