紫萁貫眾中流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選△

郎爽，閆艷韜，劉暢，楊錦，王子健，高增平*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029

流感病毒為正粘病毒科帶有節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA基因組的包膜病毒，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒宿主范圍較廣，在傳播過程中易發(fā)生變異，對人類的健康造成極大的威脅[1-3]。神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是流感病毒表面的一種包膜糖蛋白，其與流感病毒的復(fù)制和傳播過程關(guān)系密切，NA抑制劑主要是通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，來阻斷流感病毒的生命周期[4]。因NA活性位點在A、B型流感病毒中均高度保守，設(shè)計研發(fā)神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物可以同時治療A、B型流感，這使得NA成為抗流感病毒藥物研究中的理想靶點[5-7]。隨著對奧司他韋、扎那米韋等NA抑制劑耐藥的流感病毒株的出現(xiàn)[8]，開展新型NA抑制劑的研究十分重要。紫萁貫眾為紫萁科紫萁屬植物紫萁OsmundajaponicaThunb的干燥根莖和葉柄殘基，味苦，性微寒，能清熱解毒，止血殺蟲，用于疫毒感冒，熱毒瀉痢，癰瘡腫毒等，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》一部。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，紫萁貫眾具有抗病毒、抗菌、抗癌、提高機體免疫力等作用[9]，但有關(guān)其抗流感病毒NA活性的研究鮮有報道。本研究擬運用分子對接技術(shù)將紫萁貫眾中的化合物進行抗流感病毒活性虛擬篩選，同時候選化合物抑制NA活性通過神經(jīng)氨酸酶抑制實驗來驗證，從而在紫萁貫眾中篩選出流感病毒NA抑制活性最好的單體，為尋找新的抗流感病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 研究應(yīng)用軟件

繪圖軟件：ChemDraw Ultra 8.0、Chem 3D Ultra 8.0；對接軟件：AutoDock Vina、AutoDock Tools 1.5.6、LigPlus 和PyMOL。

1.2 藥物與試劑

無水氯化鈣、氫氧化鈉、冰醋酸(北京化工廠)；甘氨酸(Biotech)；2-N-嗎啡林-乙磺酸(MES，Sigma)；甲型H1N1流感病毒(A/California/04/2009)；神經(jīng)氨酸酶(北京 Sino Biological Inc.公司)；磷酸奧司他韋膠囊(羅氏制藥有限公司)；MUNANA(2′-4-Methylumbellifery-α-N-acetylneuraminic acid，Sigma公司)；紫萁酮(批號：111888-201001，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)，異銀杏素(批號：PRF9092901，純度≥98%，成都普瑞法有限公司)。

1.3 主要儀器

MS300磁力攪拌器(上海般特儀器有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)，超凈工作臺(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，數(shù)字式酸度計(德國賽多利斯股份公司)，SpectraMax I3X熒光酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，移液器(德國Eppendorf股份公司)，黑色底透96孔板(美國Costar公司)。

2 方法

2.1 紫萁貫眾中NA抑制劑的虛擬篩選

2.1.1 配體準(zhǔn)備 將23個紫萁貫眾中的單體化合物(Z1～Z23)(見表1)，應(yīng)用ChemDraw Ultra 8.0畫出其二維結(jié)構(gòu)，保存格式為mol；再通過Chem 3D Ultra 8.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，通過MM2力場進行能量最優(yōu)化，保存格式為pdb；最后應(yīng)用Autodock Tools對小分子配體進行加氫、加電荷、計算電荷，保存為pdbqt文件備用。

表1 紫萁貫眾中23個化合物的類別、編號及名稱

2.1.2 流感病毒靶蛋白的篩選與處理 對接研究采用的病毒蛋白晶體結(jié)構(gòu)來源于PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，在PDB數(shù)據(jù)庫下載復(fù)合有已知活性化合物(原配體)的NA為靶蛋白受體，共18個包括9個NA亞型(N1～N9)，見表2。用UCSF Chimera及MGL Tools 1.5.6軟件對蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進行處理，對蛋白質(zhì)進行去水、加極性氫、加電荷、修改電荷，生成pdbqt文件備用。

2.1.3 分子對接參數(shù)的確定使用 UCSF Chimera軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的原始配體提取出來，再利用Autodock Vina將原始配體對接回處理好的受體蛋白結(jié)合位點，利用MGL Tools軟件建立格點能量圖參數(shù)文件。根據(jù)原配體的坐標(biāo)文件設(shè)置Grid Box中心坐標(biāo)，設(shè)置盒子大小使預(yù)對接的分子在它最伸展的狀態(tài)下也能在盒子內(nèi)轉(zhuǎn)動，且能包括原配體與受體相互作用的所有氨基酸，其他參數(shù)均為默認(rèn)值，生成格點文件備用。

表2 與流感疾病相關(guān)的神經(jīng)氨酸酶(NA)靶蛋白受體

2.1.4 分子對接 AutoDock Vina軟件會綜合考慮小分子配體的位置、角度及可旋轉(zhuǎn)鍵等因素進行對接計算，得出化合物與靶蛋白的結(jié)合能，對接參數(shù)均為默認(rèn)值，其過程是尋找配體與受體在活性位點結(jié)合處結(jié)合能較低的構(gòu)象。利用Ligplus 軟件觀察紫萁貫眾中篩選的化合物與NA中相互作用的氨基酸殘基及疏水作用基團。

2.2 候選化合物的神經(jīng)氨酸酶抑制實驗

采用經(jīng)典的底物熒光法進行酶活性測定[10]。實驗設(shè)置空白對照組、模型對照組、陽性對照(奧司他韋)組、候選化合物組，每組設(shè)5個重復(fù)孔。各組反應(yīng)體系所加試劑見表3。

表3 NA活性測定方法 μL

抑制率=(模型對照熒光數(shù)值-待測樣品熒光數(shù)值)/
(模型對照熒光數(shù)值-空白對照熒光數(shù)值)×100%

(1)

利用GraphPad Prism軟件擬合曲線，得到各個藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子對接結(jié)果與分析

3.1.1 實驗條件準(zhǔn)確性驗證 使用UCSF Chimera軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的原配體提取出來，再利用AutoDock Vina將原配體對接回處理好的受體蛋白結(jié)合位點中，對接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差RMSD<2?，且對接后在活性口袋中與受體發(fā)生作用的氨基酸殘基能較好地和原配體的氨基酸殘基保持一致，那么證明該方法能較好地重復(fù)出原受體-配體結(jié)合的構(gòu)象，具體結(jié)果見圖1。

圖1 對接后的配體分子與原配體分子構(gòu)象疊合圖

3.1.2 化合物與NA的結(jié)合能 分子對接過程涉及配體與受體之間的空間匹配和能量匹配，空間匹配是分子間發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)，能量匹配是分子間保持穩(wěn)定結(jié)合的基礎(chǔ)，因此結(jié)合能是篩選活性分子的關(guān)鍵[11]。綜合23個化合物與18個受體的結(jié)合能，對接結(jié)果表明前5名的化合物與各類型的NA的結(jié)合能均較低(7.4～10.5 kcal·mol-1)，提示它們對各類型、亞型的NA均具有一定的抑制作用，同時可以發(fā)現(xiàn)化合物單體Z21與18個受體的結(jié)合能大多數(shù)低于其他4個化合物，結(jié)果見表4。

表4 排名前五的化合物與NA作用的結(jié)合能值 kcal·mol-1

3.1.3 化合物與NA的結(jié)合模式 有研究者根據(jù)神經(jīng)氨酸酶蛋白各亞型晶體結(jié)構(gòu)將其分為兩類，第一類有N1、N4、N5、N8；第二類有N2、N3、N6、N7、N9等，這兩類神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)的不同之處主要體現(xiàn)在150-loop(147～152位氨基酸殘基)和150-cavity。在第一類的晶體結(jié)構(gòu)中，150-loop呈開放狀態(tài)，這使其活性中心可以延伸到150-cavity；而在第二類的晶體結(jié)構(gòu)中，150-loop是閉合的，故其活性中心與150-cavity不連續(xù)[12]。從這些化合物與NA活性口袋的結(jié)合模式看，紫萁貫眾中的黃酮類化合物可同時嵌入第一類NA(N1、N5、N8)的活性口袋和150-cavity內(nèi)，而其他類化合物只能單獨地嵌入活性口袋中，以化合物與NA(3CKZ)結(jié)合模式為例展示(見圖2)，因此推測紫萁貫眾中黃酮類化合物抗NA活性高于其他類化合物。

3.1.4 化合物與活性口袋中氨基酸殘基的作用情況 配體-NA復(fù)合物的穩(wěn)定性不僅依賴于配體分子與NA之間的氫鍵作用，還依賴于配體分子與NA之間的疏水作用[13]，與氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用基團越多，氫鍵距離越短，相互作用越緊密，對降低結(jié)合能貢獻越大，從而阻礙宿主體內(nèi)受體蛋白與唾液酸的結(jié)合，對病毒產(chǎn)生抑制作用。根據(jù)與NA結(jié)合模式推測，對紫萁貫眾中黃酮類化合物與氨基酸殘基的作用情況進行分析，結(jié)果表明它們不僅能夠與ARG118、ARG371、ARG292等重要氨基酸殘基產(chǎn)生氫鍵作用，還與其他不同于傳統(tǒng)結(jié)合位點的氨基酸產(chǎn)生相互作用，以結(jié)合能得分最低的化合物Z21為例展示(見表5)。

圖2 紫萁貫眾中各類化合物與NA(3CKZ)的三維結(jié)合模式圖

綜合考慮化合物的結(jié)合能、與活性口袋的結(jié)合模式以及與氨基酸殘基的作用情況，篩選出Z21作為候選化合物，同時化合物Z17紫萁酮在紫萁貫眾中含量較高，為2015版《中華人民共和國藥典》中紫萁貫眾鑒別的對照品，故選擇Z17和Z21化合物進行活性驗證。20世紀(jì)爆發(fā)的4次世界大流感，其中2次是由于H1N1引起的，其具有易感染人體且致命性強的特點，因此選用H1N1的神經(jīng)氨酸酶。

表5 紫萁貫眾中化合物Z21與NA的對接結(jié)果

續(xù)表5

3.2 候選化合物對流感病毒NA的活性

兩個候選化合物對NA均有不同程度的抑制作用(見表6)，其中Z21異銀杏雙黃酮對NA的抑制作用較為顯著，IC50值為 (42.54±2.85) μmol·L-1。

4 討論

NA是A、B型流感病毒的表面蛋白，其在流感病毒的感染和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，且其活性位點高度保守，是抗流感藥物的重要靶點。本研究應(yīng)用分子對接軟件研究紫萁貫眾中各類化合物抑制流感病毒NA的作用，從結(jié)合能結(jié)果看，紫萁貫眾中的黃酮類與NA的結(jié)合能較低，通過分析其與NA的結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能夠同時嵌入NA的活性口袋和150-cavity；經(jīng)過分析化合物與活性口袋中氨基酸殘基的作用情況，表明黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的羰基、羥基和醚基能夠不同程度地與NA中的重要氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用，而不同于傳統(tǒng)結(jié)合位點的氨基酸殘基也能與之相互作用。綜合以上分析，從理論上證實了紫萁貫眾中的黃酮類化合物是與NA作用最有潛力的化合物，神經(jīng)氨酸酶抑制活性驗證實驗的結(jié)果表明：候選化合物異銀杏雙黃酮對NA有較顯著的抑制作用，IC50值為(42.54±2.85)μmol·L-1。

表6 候選化合物對NA的抑制活性