東北雷公藤DXR HMGR基因克隆及生物信息學分析△

郭思遠，閆琦，李佳

首都醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，北京 100069

東北雷公藤TripterygiumregeliiSpragus et Takeda系衛(wèi)矛科Celastraceae雷公藤屬植物，主要含有二萜類、三萜類、生物堿類等成分，具有免疫調節(jié)[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]等作用。萜類化合物(如雷公藤紅素等)是東北雷公藤主要生物活性物質之一[4]，其分子結構以異戊二烯為基本單位，經由甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑和甲基赤蘚醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate，MEP)途徑生物合成。研究表明[5]，HMGR和DXR分別是MVA途徑和MEP途徑的關鍵酶，其基因表達水平可直接影響植物萜類物質的合成。

本研究克隆獲得TrDXR、TrHMGR基因全長，并對其所編碼的蛋白進行理化性質、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位、二三級結構預測及同源性和系統(tǒng)進化樹分析，為鑒定TrDXR和TrHMGR基因功能、揭示雷公藤屬植物萜類物質分子形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

東北雷公藤采自吉林通化，經首都醫(yī)科大學李佳教授鑒定為衛(wèi)矛科植物東北雷公藤TripterygiumregeliiSpragus et Takeda。取其根、莖洗凈后至于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄 以CTAB法提取東北雷公藤根和莖混合總RNA，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。參照SMARTer RACE 5′/3′ kit試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書，將RNA反轉錄合成cDNA。

1.2.2 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因克隆 分析東北雷公藤轉錄組數(shù)據，篩選得到TrDXR基因2條，TrHMGR基因4條，經分析其中1條TrDXR基因，1條TrHMGR基因為全長。使用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件對序列進行開放閱讀框(open reading frame，ORF)分析，運用Primer Premier 5.0 軟件在ORF兩端設計引物(見表1)。引物序列委托北京睿博興科生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物

以東北雷公藤cDNA為模板進行PCR，50 μL反應體系包括：2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，cDNA模板2 μL，正、反向引物各1.5 μL，ddH2O 20 μL。反應條件為：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后按DNA純化回收試劑盒(天根生物公司)說明書純化回收，并與Trans pEASY-βzero克隆載體連接。連接產物轉化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)約14 h，挑取陽性單菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)約6 h，菌液PCR無誤后送至北京睿博興科生物技術有限公司測序。

1.2.3 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因生物信息學分析 使用SeqMan軟件對測序結果進行分析，使用Editseq軟件將測序正確的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。使用ExPASy中ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam)預測蛋白相對分子質量與理論等電點；TargetP 3.0 server(http：//www.cbs.dtu. dk/services/TargetP/)進行信號肽分析；TRMHMM server v2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行跨膜結構分析；ProtComp Version 9.0(http：//www.softberry.com/berry.phtml)分析亞細胞定位；PRABI-GERLAND(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)進行二級結構預測；SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進行三維模型預測。使用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中蛋白-蛋白BLAST工具進行氨基酸序列比對，根據BLAST結果下載同源序列，使用DNAMAN進行多重比對，并根據多重比對結果用MEGA 6.0軟件構建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 RNA提取及反轉錄結果

取東北雷公藤混合總RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖1)，28 S和18 S條帶清晰完整。經超微量分光光度計檢測，總RNA質量濃度為300～400 ng·μL-1，A260 nm/A280 nm介于2.0～2.2，A260 nm/A230 nm>1.8，符合實驗要求，可進行下步實驗。cDNA能擴增出目的基因，說明反轉錄成功。

圖1 東北雷公藤總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 東北雷公藤TrDXR、TrHMGR基因克隆結果

取PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)，目的條帶在1500～2000 bp，與預期長度一致。陽性菌液測序結果與預期序列對比，序列相似度99%，表明克隆成功。TrDXR基因ORF區(qū)長度為1410 bp，編碼氨基酸469個；TrHMGR基因ORF區(qū)長度為1770 bp，編碼氨基酸589個。

注：1～2泳道對應的基因為TrHMGR；3～4泳道對應的基因為TrDXR。圖2 TrDXR、TrHMGR基因電泳圖

2.3 理化性質預測

TrDXR蛋白的相對分子質量為51 126.87 kDa，理論等電點為5.94，為酸性蛋白。帶正電殘基為54，帶負電殘基為47；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.37，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為97.76，親水性系數(shù)為-0.044，預測該蛋白為親水性蛋白。TrHMGR蛋白的相對分子質量為61 583.08 kDa，理論等電點為6.62，為酸性蛋白。帶正電殘基為57，帶負電殘基為56；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.92，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為95.47，親水性系數(shù)為0.130，預測該蛋白為疏水性蛋白。半衰期體外預測，兩者均在哺乳動物的網織紅細胞中為30 h，在酵母菌中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。

2.4 轉運肽分析

TrDXR葉綠體轉運肽得分為0.905、線粒體轉運肽得分為0.078、分泌途徑轉運肽得分為0.017，其他得分為0.083，定位于葉綠體，RC為1。TrHMGR葉綠體轉運肽的分數(shù)是0.001 1、線粒體轉運肽的分數(shù)是0.472、分泌途徑轉運肽的分數(shù)是0.047，其他的分數(shù)是0.041 3，無定位，RC為5。因此初步認定TrDXR存在轉運肽，定位于葉綠體；TrHMGR不存在轉運肽。

2.5 跨膜結構域與亞細胞定位分析

跨膜結構域分析顯示，TrDXR為膜外蛋白，不存在跨膜結構；TrHMGR為跨膜蛋白，蛋白49～71和92～114氨基酸區(qū)域為跨膜結構區(qū)(見圖3)。亞細胞定位預測顯示，TrDXR定位于葉綠體，TrHMGR定位于內質網。研究認為MEP途徑與MVA途徑分別定位于質體和細胞質，亞細胞定位預測結果與研究結果相符[6]。

注：A.TrDXR；B.TrHMGR。圖3 跨膜結構域分析

2.6 二級結構及三級結構模型預測分析

二級結構預測顯示，TrDXR蛋白α螺旋占39.02%，延伸鏈占11.30%，隨機卷曲占49.68%；TrHMGR蛋白α螺旋占42.67%，延伸鏈占2.67%，隨機卷曲占54.67%(見圖4)。三維模型預測分析顯示，TrDXR以1jvs.1.B蛋白為模板進行同源建模，建模范圍為73～462位氨基酸，序列同源性為43.38%。TrDXR的N-端和C-端在空間結構上折疊成V形，其內部含有多個氨基酸殘基可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和硫酸根離子(SULFATE ION)結合。TrHMGR以1dq 9.1.C蛋白為模板進行同源建模，建模范圍為171～555位氨基酸，序列同源性為55.64%。TrHMGR含有4個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)結合域，由4個高度保守區(qū)域經折疊后兩兩組成(見圖5)。

注：A.TrDXR；B.TrHMGR；藍色：α螺旋；紅色：延伸鏈；綠色：β轉角；紫色：無規(guī)則卷曲。圖4 TrDXR、TrHMGR蛋白二級結構預測

注：A.TrDXR；B.TrHMGR。圖5 TrDXR、TrHMGR蛋白三維模型預測

2.7 多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

選取不同物種已表征功能的DXR和HMGR構建系統(tǒng)進化樹(見圖6～7)，結果顯示TrDXR和TrHMGR編碼氨基酸分別與雷公藤DXR和HMGR聚類為一支，置信度高達100，親緣關系最近。根據系統(tǒng)進化分析結果選取親緣關系較近的蛋白序列進行多序列比對(見圖8～9)，結果顯示TrDXR與同源蛋白序列一致性為92.44%，TrHMGR與同源蛋白序列一致性為88.22%。由此可見東北雷公藤DXR和HMGR與不同物種同源序列的相似性高，保守性強。TrDXR在其N-端含有2個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)結合功能域GSTGSIGT和LAAGSNV，在其肽鏈中間含有2個DXR活性位點PADSEHSAS和NKGLEVIEAHY；TrHMGR在其N-端含有2個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)結合功能域EMPVGYVQIP和TTEGCLVA，在其C-端含有2個NADPH結合功能域DAMGMNM和GTVGGGT。這些結合功能域和活性位點對植物DXR和HMGR功能至關重要，因此在進化時高度保守。

圖6 TrDXR的系統(tǒng)進化樹

圖7 TrHMGR的系統(tǒng)進化樹

圖8 不同植物DXR氨基酸序列的多重比對

圖9 不同植物HMGR氨基酸序列的多重比對

3 討論

雷公藤甲素和雷公藤紅素等萜類化合物是雷公藤的主要活性成分，其在植物體內主要由MEP途徑和MVA途徑進行生物合成。HMGR和DXR分別是MVA途徑和MEP途徑的限速酶[7-8]，研究表明，過表達TwHMGR基因可使雷公藤懸浮細胞中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量顯著上升[9]，過表達TwHMGR基因和TwDXR基因可使雷公藤發(fā)狀根中雷公藤內酯醇、雷公藤吉堿和雷公藤次堿的含量明顯升高[10]，而抑制雷公藤DXR基因的表達可使懸浮細胞中雷公藤紅素和雷公藤內酯醇含量下降[11]。由此可見，DXR和HMGR基因在調控雷公藤甲素、紅素等萜類物質的生物合成中發(fā)揮著重要作用。但也有文獻指出，基因表達存在著復雜的調節(jié)機制[12-13]，對途徑上游基因的調節(jié)能否專一性改變特定化合物的產量還有待進一步研究[14]。

研究表明，雷公藤屬植物中均含有雷公藤甲素和雷公藤紅素[15]，且東北雷公藤根中雷公藤紅素的含量明顯高于其他兩個物種[16]。因此，本研究擬通過基因克隆及生物信息學分析初步探究東北雷公藤中萜類成分生物合成關鍵酶基因TrHMGR、TrDXR的生物功能，以挖掘更多具有相似功能的基因序列，豐富可用的基因資源。本研究獲得東北雷公藤DXR、HMGR基因各1條，并對其理化性質、蛋白結構、親緣關系及功能位點進行了預測，為下一步鑒定基因功能打下基礎，為進一步通過基因改良手段提高東北雷公藤中萜類成分含量、利用合成生物學策略異源高產雷公藤紅素甲素做出鋪墊。