藥用植物抗逆性反應(yīng)的分子遺傳機制研究△

王超群，梁乙川，陳士林，李孟芝，董林林*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100010；2.蘭州大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

近年來，隨著人們健康觀念的轉(zhuǎn)變和新型藥用劑型的發(fā)展，中藥逐漸在國際范圍內(nèi)被認可，并且在保健品、化妝品、食品等方面的市場需求量也急劇增長。然而，藥用植物在生長過程中遭受的各種逆境，如病蟲害、高溫、低溫、干旱、鹽堿等，可能會導(dǎo)致藥材產(chǎn)量減少甚至失收，或者對藥用植物的生長發(fā)育造成影響，使其品質(zhì)降低甚至失去藥用或商品價值[1-4]，造成嚴重的損失。為有效增加藥材產(chǎn)量、提高藥材品質(zhì)，迫切需要培育出可以在多種逆境下健康生長的藥用植物。因此，解析植物能夠適應(yīng)各種逆境的調(diào)控基因以及相應(yīng)分子機制對提出更有效的藥用植物改良策略非常重要。

1 植物抗逆類型及其分子機制

1.1 抗生物脅迫類型及其分子機制

微生物在植物生長環(huán)境中無處不在，有的可以獨立生存，也有的會與宿主共生或者寄生宿主使宿主致病。與各種微生物的長期共存，使植物逐漸進化出復(fù)雜精細的防御系統(tǒng)以防止被感染致病。近年來，研究人員經(jīng)常將植物抗病性與哺乳動物的免疫進行比較，引入“植物免疫”概念。顯然，哺乳動物免疫機制與植物抗病機制之間存在根本差異，雖然植物缺乏哺乳動物所具備的適應(yīng)性免疫[5-6]，但在植物體內(nèi)，主動防御微生物病原體的系統(tǒng)包括許多復(fù)雜的防御信號通路，一部分可以在感染部位的局部提供保護，而另一部分則在整個植物體內(nèi)提供系統(tǒng)抗性，包括未感染的遠端組織中[7-10]。局部抗性又包括在物種水平對非寄主病原體的抗性、對毒性病原體的基礎(chǔ)抗性以及對無毒(Avr)病原體的種族特異性抗性[11-13]。當(dāng)植物細胞質(zhì)膜上的模式識別受體(PRRs)識別病原菌表面的病原相關(guān)分子特征(PAMP)時，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生基礎(chǔ)免疫，即病原相關(guān)分子特征觸發(fā)的免疫(PTI)，而菌株特異性AVR蛋白直接或間接地與同源植物抗病(R)蛋白相關(guān)聯(lián)時，會產(chǎn)生特異性抗性，即效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫(ETI)[14-16]。

1.1.1非特異性的免疫反應(yīng)

1.1.1.1 非寄主抗性 某一植物物種對一種致病微生物物種的所有個體都有的抗性被稱為非寄主抗性，即物種水平上的抗性。它是植物抗病過程中最基本、最持久的廣譜抗病形式[17-18]。植物存在的物理屏障，如葉片角質(zhì)層，可以防止大多數(shù)病原菌進入植物組織，但是仍然有部分病原體可以通過一些天然開口，例如氣孔，或者植物表面的傷口進入質(zhì)外體空間[18]。在這里，植物防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，可以限制病原體的生長繁殖。除了細胞壁、蠟質(zhì)層、相關(guān)的酶和抗菌素等一些預(yù)先存在的防御外，植物還會進一步發(fā)生誘導(dǎo)性非寄主防御反應(yīng)[19-20]。

植物對致病菌產(chǎn)生的非寄主抗性可分為兩種類型，一種是不會產(chǎn)生任何明顯的癥狀，而另一種則會導(dǎo)致局部細胞壞死并引起迅速的超敏反應(yīng)[7，11，20-21]。有研究表明多胺是煙草在感染非寄主病原體P.cichorii后引起超敏反應(yīng)的重要ROS源[22]。也有報道顯示，線粒體中脯氨酸的分解代謝過程，特別是吡咯啉-5-羧酸鹽(P5C)的富集，可以引起伴隨著ROS積累和胼胝質(zhì)沉積的特征性超敏反應(yīng)樣病變[20，23]。Senthil-Kumar等[23]的研究結(jié)果顯示，脯氨酸分解代謝過程中參與P5C合成的鳥氨酸δ-氨基轉(zhuǎn)移酶和脯氨酸脫氫酶與擬南芥防御非寄主病原體過程相關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)相應(yīng)編碼基因(δOAT、ProDH1和ProDH2)的突變體在非寄主病原體侵染時超敏反應(yīng)發(fā)生遲緩，活性氧(ROS)的產(chǎn)生減少，并且損失了部分非寄主抗性。

ROS在植物對病原體產(chǎn)生非寄主抗性過程中發(fā)揮著重要的作用。Kiraly等[7]通過研究證明超氧化物在白粉病感染的小麥中的富集時間遠早于在同一品系小麥感染無毒白粉病時的富集。除了NADPH氧化酶在非寄主病原體感染植物時活性增強外，乙醇酸氧化酶(GOX)介導(dǎo)的光呼吸過程產(chǎn)生的ROS也在植物發(fā)揮非寄主抗性時累積[24]。Sang-Keun等[21]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥感染非寄主病原體P.syringaepv.Tabaci時，GOX的編碼基因(AtGOX3、AtHAOX1和AtHAOX2)被高度誘導(dǎo)，產(chǎn)生大量ROS，并引起超敏反應(yīng)。

植物細胞壁上胼胝體的沉積是防御非寄主病原體時常見表現(xiàn)形式。胼胝體的沉積過程依賴于活性氧的累積[25]、激素信號傳導(dǎo)[26]以及吲哚芥子油苷的生物合成[27]。Raksha等[28]報道了煙草中參與非寄主抗性的一種新基因NbNHR2，并且在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了兩種直系同源物——AtNHR2A和AtNHR2B，這兩種基因的擬南芥突變體對煙草假單胞菌的非特異性病原體敏感，而且在胼胝體沉積方面存在缺陷，通過進一步的研究表明，AtNHR2A和AtNHR2B位于葉綠體中并相互作用，因此研究者們提出AtNHR2A和AtNHR2B是葉綠體介導(dǎo)的免疫信號傳導(dǎo)途徑的新成員，其在非寄主抗性期間介導(dǎo)細胞壁中的胼胝體沉積以響應(yīng)非寄主病原體。

植物還可以通過利用甾醇類物質(zhì)控制營養(yǎng)外排，減少非寄主病原體賴以生存的原生質(zhì)體中的營養(yǎng)物質(zhì)來抑制病原菌的生長[29-30]。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)下調(diào)甾醇生物合成過程中的關(guān)鍵酶——角鯊烯合成酶(SQS)的活性后，植物細胞營養(yǎng)外排增加，從而促進了病原菌的生長，使植物對少量丁香假單胞菌和野油菜黃單胞菌病原體的非宿主抗性降低；同時，通過研究證明了SQS通路下游相關(guān)基因(Atcyp710A1)的突變促進了病原體P.syringaepv.Tabaci(煙草野火病的致病因子)和P.syringaepv.Syringi在擬南芥中的生長。對于此過程，研究者們猜測可能是通過改變細胞質(zhì)膜的滲透性實現(xiàn)的。

除了以上之外，PTI和ETI在非寄主抗性中也發(fā)揮著重要的作用。例如，擬南芥中的模式識別受體AtFLS2可以有效識別非寄主病原體丁香假單胞菌pv.Phaseolicola，有助于擬南芥對該病原體發(fā)揮非宿主抗性[31]。而擬南芥有效識別非宿主病原體丁香假單胞菌的效應(yīng)因子hopAS1則觸發(fā)了ETI[32]。

1.1.1.2 基礎(chǔ)抗性 這種形式的抗性發(fā)生在宿主-病原體相互作用的早期，是通過細胞表面的模式識別受體(PRR)識別在微生物和病原體中廣泛存在而植物中不存在的分子特征，即病原體或微生物相關(guān)的分子模式(PAMP/MAMP)，來觸發(fā)的抗性[33-34]。目前，細菌鞭毛蛋白N端的保守區(qū)域(flg22)和延伸因子Tu(EF-Tu)是研究最多的PAMP[35-36]。脂多糖、肽聚糖、harpins、壞死和乙烯誘導(dǎo)多肽-1、源于真菌的幾丁質(zhì)寡糖等是存在于微生物中并且可以被PRR識別的其他PAMP[37]。目前已經(jīng)表征的PRR相關(guān)結(jié)構(gòu)域有富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)、賴氨酸基序(LysMs)和表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域。通常，LRR可以結(jié)合蛋白質(zhì)或肽，例如在擬南芥中flg22和EF-Tu的識別分別依賴于受體類蛋白激酶FLS2和 EFR。LysMs結(jié)構(gòu)域主要結(jié)合糖類，如肽聚糖和幾丁質(zhì)。EGF樣結(jié)構(gòu)域則用于結(jié)合寡聚半乳糖醛酸[34]。植物PRRs識別入侵病原體的PAMPs分子之后激活一系列信號傳導(dǎo)過程，如絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)途徑、水楊酸/茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑等，從而迅速引發(fā)多種防御反應(yīng)，如感染部位胼胝體的沉積、ROS和酚類化合物的富集以及相關(guān)防御基因的激活等[38-39]。有研究報道了經(jīng)過工程改造后表達擬南芥EFR的轉(zhuǎn)基因番茄和煙草能夠檢測到來自病原菌的EF-Tu蛋白并誘導(dǎo)有效的防御反應(yīng)[40]。

1.1.1.3 小種非特異性抗性 可以有效對抗真菌感染的非特異性抗性有兩種重要形式，一種是種族非特異性抗性，主要對大麥白粉病的幾種致病菌產(chǎn)生防御[7]。由Mlo基因的隱性等位基因(mlo)編碼，作用持久[41]。大麥Mlo基因編碼的跨膜蛋白(Bax抑制劑-1)是程序性細胞死亡和對白粉病發(fā)揮抗性的負調(diào)節(jié)物，過度表達可導(dǎo)致mlo基因介導(dǎo)的對大麥白粉病抗性的破壞[42]。相關(guān)研究表明功能性Mlo基因也存在于雙子葉植物擬南芥中，因此，mlo基因介導(dǎo)的對白粉病的非特異性抗性可能是植物中的普遍現(xiàn)象[43]。而第二種形式是與限速和慢孢子形成有關(guān)的抗性。當(dāng)宿主對致病菌易感并且被成功感染時，植物發(fā)揮相應(yīng)防御導(dǎo)致真菌繁殖體的產(chǎn)生非常緩慢而且水平較低。這種形式的抗性在植物中是廣泛存在的，例如在銹病或馬鈴薯晚疫病的致病菌感染時植物產(chǎn)生抗性，使真菌的繁殖速度減緩[44]。由mlo基因介導(dǎo)的非特異性抗性發(fā)揮作用時，主要通過形成增厚的細胞壁限制病原體的生長[7]。上述非特異性抗性都與HR無關(guān)，但是一些早期的研究表明，ROS在發(fā)揮mlo基因介導(dǎo)的非特異性抗性后的葉片細胞中積累，但它們的作用尚未被明確證實[45]。

1.1.2 特異性的免疫反應(yīng) 雖然植物具備包括PTI在內(nèi)的非特異性抗性，但是在自然界中，一些病原體的效應(yīng)因子可以通過抑制宿主的PRR識別來克服這一防御層。因此，植物在長期過程中進化出了可以識別病原體效應(yīng)因子的抗性蛋白(R蛋白)，并觸發(fā)另一水平的防御反應(yīng)，即ETI。

病原體無毒基因(AVR)編碼的效應(yīng)因子，由Ⅲ型分泌途徑(T3SS)進入植物細胞，通過發(fā)揮相應(yīng)作用來抑制PTI[46]。例如丁香假單胞菌P.syringae中的一些效應(yīng)因子，如AvrPtoB可以對FLS2進行泛素修飾，抑制細菌鞭毛蛋白的識別；AvrPphB則可以特異性降解PTI過程中的相應(yīng)激酶，抑制信號的傳遞[47]；效應(yīng)因子HopI1可以抑制水楊酸的累積，影響通路的信號傳遞，降低宿主對病原體的抗性[48]。

目前將已經(jīng)鑒定出來的R蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同分為兩類。第一類R蛋白具有核苷酸結(jié)合位點(NB)并且富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)，與果蠅的Toll受體和哺乳動物的白細胞介素(IL)受體的中一些蛋白質(zhì)同源[49-50]。丁香假單胞菌P.syringae的效應(yīng)因子AvrPto和AvrPtoB在番茄中與NB-LRR家族蛋白Prf相互作用；效應(yīng)因子AvrB、AvrRpm1、AvrRpt2 和AvrPphB與擬南芥中的NB-LRR蛋白RPM1、RPS2和RPS5相互作用，均引發(fā)抗性[51]。第二類R蛋白是胞外LRR，包括受體類似蛋白、受體類似激酶和多聚半乳糖醛酸鎂抑制蛋白。R蛋白識別效應(yīng)因子后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活，病原體的生長受到抑制，該過程可能與HR和細胞壞死有關(guān)[7]。目前關(guān)于R蛋白識別效應(yīng)因子過程的原理主要有兩種解釋。其一是直接識別，即植物R蛋白對相應(yīng)的病原體AVR蛋白直接識別，例如水稻稻瘟病致病菌的效應(yīng)因子AvrPita和R蛋白Pi-ta被證明產(chǎn)生了直接作用[52]。但是從目前的相關(guān)研究可以看出，這種直接識別在植物體內(nèi)并不常見，而更為普遍的是另一種“防衛(wèi)假說”，也就是病原體的效應(yīng)因子通過與植物中的相應(yīng)靶蛋白作用，可能會導(dǎo)致靶蛋白的構(gòu)象變化，使靶蛋白可以作用并激活宿主R蛋白，從而完成間接識別[7]。擬南芥中R蛋白在未感染的健康植物中因為抑制蛋白的負調(diào)節(jié)作用而受到抑制，感染假單胞菌后，Avr蛋白可能是通過改變該負調(diào)節(jié)因子(靶蛋白)的磷酸化狀態(tài)使其構(gòu)象發(fā)生了變化，或者是直接將靶蛋白水解，使R蛋白從被抑制的狀態(tài)中釋放出來，從而實現(xiàn)間接識別，激活信號傳遞，實現(xiàn)對病原體的防御。例如現(xiàn)已證實，擬南芥中的靶蛋白RIN4至少控制兩條R蛋白-AVR蛋白識別通路，即AvrRpm1/AvrB-RIN4-RPM1 和AvrRpt2-RIN4-RPS2，兩條途徑分別是通過磷酸化和水解蛋白來激活抗性的[53]。

1.1.3 系統(tǒng)獲得性抗性 當(dāng)植物R蛋白直接或間接識別病原體的效應(yīng)因子，激活ETI時，感染部位通常會產(chǎn)生HR，引起程序性細胞死亡(PCD)，除此之外，病原體AVR蛋白還誘導(dǎo)一些信號物質(zhì)的產(chǎn)生，如水楊酸(SA)，壬二酸，甘油-3-磷酸等，通過信號傳導(dǎo)使植物未感染的遠端組織中病程相關(guān)(PR)基因表達以保護植物其余部位免受繼發(fā)感染，這種現(xiàn)象稱為系統(tǒng)獲得性免疫(SAR)[54-55]。植物中SAR賦予的免疫“記憶”可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，甚至更久。與ETI相反的是，SAR與PCD無關(guān)，相反可以促進細胞存活[55，56]。

SA是SAR信號傳導(dǎo)過程中的重要信號分子。在病原體感染植物后，SA迅速在體內(nèi)累積。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)NahG(水楊酸羥化酶)基因的煙草在煙草花葉病毒感染時，遠端組織無法積累SA也不能誘導(dǎo)SAR的產(chǎn)生，與正常煙草相比壞死更多[57]。另外，轉(zhuǎn)錄因子也參與SAR的信號傳導(dǎo)過程。其中NPR1(病程相關(guān)基因非表達子1)和WRKY是SA信號傳導(dǎo)途徑的兩種重要的轉(zhuǎn)錄因子。SA可以促使NPR1活化和向細胞核的轉(zhuǎn)移，通過和TGA轉(zhuǎn)錄因子相互作用引起抗病基因的表達[58]。WRKY則是通過PR基因啟動子區(qū)域的W盒(C/TTGACC/T)來調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達[59]?？梢苿有盘栐陧g皮部的運輸是SAR發(fā)生的關(guān)鍵，但是研究表明SA并不是可移動的信號分子。通過相關(guān)實驗證明SA可以在病原體初次侵染的組織中轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w信號MeSA，被運輸?shù)较到y(tǒng)組織后，MeSA又重新轉(zhuǎn)化為SA發(fā)揮作用[60]。而Truman等[61]則發(fā)現(xiàn)當(dāng)擬南芥受到病原菌感染后，JA在韌皮部迅速累積，系統(tǒng)組織中的JA含量也在短時間內(nèi)上升后又恢復(fù)正常水平，相反SA的含量卻沒有明顯變化。因此，研究者們猜測MeSA和JA可能是SAR發(fā)生過程中的可移動信號分子。

1.2 抗非生物脅迫類型及其分子機制

植物在生長過程中會遇到影響正常生長發(fā)育的各種非生物逆境，長期的演化過程使植物逐漸形成了對這些不利環(huán)境因子的適應(yīng)能力，稱為抗逆性，主要分為避逆性和耐逆性。避逆性是植物在時間或空間上建立障礙以避開不良環(huán)境脅迫。耐逆性指植物通過產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)使植物在各種環(huán)境脅迫下，沒有或只是造成了相對較小的傷害[62]。植物應(yīng)對非生物脅迫時產(chǎn)生的信號傳遞包括受體偶聯(lián)磷酸轉(zhuǎn)移、磷酸肌醇誘導(dǎo)的鈣震蕩、脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活等[62-63]。

低溫環(huán)境通過植物細胞中的鈣離子信號調(diào)控相關(guān)信號的傳遞[64]。目前已知植物主要通過ICE1-CBF-COR轉(zhuǎn)錄級聯(lián)信號途徑來適應(yīng)低溫環(huán)境。在感受到低溫信號后，ICE1(CBF 表達誘導(dǎo)劑1)激活CBF(C重復(fù)結(jié)合因子)基因的表達，隨后CBF轉(zhuǎn)錄因子促進一系列冷應(yīng)答(COR)基因的表達，從而表現(xiàn)出對低溫的耐受能力[64-65]。

鹽堿和干旱主要是通過相關(guān)離子和滲透壓的變化使脫落酸(ABA)在植物體內(nèi)累積而影響植物生長的[66-67]。ABA是植物調(diào)控各種非生物脅迫耐受時的重要激素[68]。以PYR/PYL/RCAR為受體的實驗中表明，在正常情況時，蛋白磷酸激酶SnRK2s的活性被蛋白磷酸酶PP2Cs抑制，植物正常的生長，當(dāng)受到環(huán)境脅迫時，植物體內(nèi)ABA含量升高，并作用于PYR/PYL/RCAR受體，構(gòu)型發(fā)生改變后能夠與PP2Cs結(jié)合，進而使SnRK2s的磷酸化活性得到釋放，活化的SnRK2s可以通過一系列的相互作用激活抗脅迫基因的表達，實現(xiàn)植物對非生物脅迫的耐受[62，69]。

植物面對各種環(huán)境脅迫，在長期的演化過程中，逐漸形成了通過表觀遺傳修飾調(diào)控信號感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及相關(guān)基因表達。各種非生物脅迫因素可以通過調(diào)節(jié)特異的siRNA來控制基因的表達[70]。相關(guān)實驗對擬南芥和煙草進行高鹽、寒冷以及ABA處理后，發(fā)現(xiàn)植物均可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的形態(tài)應(yīng)對各種環(huán)境脅迫[71]。這種表觀遺傳修飾調(diào)控通常是在植物面對突然變化的環(huán)境時做出的快速反應(yīng)，以此應(yīng)對不良的環(huán)境脅迫[62]。

2 轉(zhuǎn)錄因子家族對抗逆基因的調(diào)控機制

植物抗逆基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物防御反應(yīng)研究中重要的領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，通過與相應(yīng)基因啟動子區(qū)域和增強子特異性相互作用，改變靶基因的染色體結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控多個與植物抗逆相關(guān)的基因表達，促進抗逆基因發(fā)揮作用，改善植物的抗逆性。參與植物抗逆反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有 bZIP(堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈)類、MYB(禽成髓細胞瘤病毒致癌基因同源物)類、AP2/ERF(乙烯應(yīng)答元件組合蛋白/因子)類、WRKY類以及NAC類轉(zhuǎn)錄因子，見表2[95-96]。

表1 植物抗逆種類和相關(guān)分子機制

2.1 bZIP類

堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP)是轉(zhuǎn)錄因子中較大的家族之一[72]。幾乎在所有真核生物中都存在含有bZIP結(jié)構(gòu)域的蛋白。在病原體誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR的SA信號傳遞過程中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員TGA蛋白與NPR1相互作用調(diào)節(jié)PR基因的表達，此外，TGA還可以與一些基因啟動子中的TGACGT順式作用元件結(jié)合來調(diào)控基因的表達。

植物在應(yīng)對環(huán)境脅迫時，bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與依賴于ABA的信號通路，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[73]。目前，大豆中已經(jīng)鑒定出131個bZIP基因并將其命名為GmbZIPs，其中1/3上的基于可以對4種環(huán)境脅迫即ABA、高鹽、干旱和低溫中的至少一種產(chǎn)生響應(yīng)。Liao等[74]分別將大豆的4種bZIP基因轉(zhuǎn)到擬南芥中過度表達，發(fā)現(xiàn)植物對高鹽和低溫脅迫的耐受性均增強。Ying等[75]得到了一個玉米bZIP基因ZmbZIP72，將其轉(zhuǎn)到擬南芥中表達發(fā)現(xiàn)植物抗旱性和耐鹽性增強，過表達后種子對ABA和滲透脅迫的敏感性也增強。

2.2 MYB類

禽成髓細胞瘤病毒致癌基因同源物(MYB)是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，一般由DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活域和負調(diào)節(jié)區(qū)NRD功能域組成[76]。MYB轉(zhuǎn)錄因子在病原體誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性過程中發(fā)揮調(diào)控作用，如通過MYB轉(zhuǎn)錄因子基因AtMyb30在擬南芥及煙草中的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C明，該基因調(diào)控植物在受到病原菌侵染時產(chǎn)生HR[77]。煙草中由Myb1基因編碼的信號復(fù)合物，可參與PR基因的激活和植物的抗病反應(yīng)[78]。除此之外，MYB類轉(zhuǎn)錄因子如擬南芥的AS1、煙草的NSPHA、玉米的RS2，還可以在JA為信號分子的抗性反應(yīng)中調(diào)控相關(guān)功能基因的表達，實現(xiàn)植物對病原菌的防御。

MYB參與植物對各種不良環(huán)境脅迫的應(yīng)答。Feng等[79]的研究證明，擬南芥中在根的柱鞘細胞中特異性表達的MYB68基因，在高溫環(huán)境下活性增強，被激活表達。SEO等[80]認為擬南芥的MYB96基因在對干旱脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮作用。相關(guān)實驗將水稻Osmyb4基因在擬南芥中的表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物對干旱、高鹽等脅迫的耐受性顯著提高[81]。而且擬南芥、玉米和紫蘇灌木中的一些MYB基因還可以參與植物光信號傳導(dǎo)途徑。

2.3 WRKY類

在植物中特有的WRNK類轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點是高度保守的WRNK結(jié)構(gòu)域。WRKY轉(zhuǎn)錄因子識別特定的核苷酸序列 (T)(T)TGAC(C/T)片段(即w-盒)。由于與植物防御相關(guān)的基因，如PR、NPR1基因，啟動子區(qū)域都包含w-盒元件，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物防御反應(yīng)上起著重要作用[82]。擬南芥中WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以在病原菌侵染時，使植物中與非寄主抗性反應(yīng)、基礎(chǔ)防御反應(yīng)、特異性抗性反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性相關(guān)的基因表達上調(diào)。AtWRKY29/AtWRKY22基因在擬南芥PRR與鞭毛蛋白相互作用的信號傳遞途徑中作用于PAPK的下游，參與介導(dǎo)擬南芥對病原菌的防御反應(yīng)[83]。

對于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物應(yīng)對非生物脅迫中的調(diào)控作用，Rizhsky等[84]研究證明，大麥HvWRKY38基因參與對低溫和干旱脅迫的應(yīng)答，在低溫條件下該基因的表達會暫時上調(diào)，但在冰凍和干旱條件下表達會持續(xù)上調(diào)。Zhou等[85]證明了擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY54能增強植株對干旱和鹽脅迫的耐受性；GmWRKY21能增強耐寒性；GmWRKY13能增強植物抗鹽性。Qiu等[86]發(fā)現(xiàn)水稻在受到ABA以及高鹽、干旱、低溫和滲透脅迫時，QsWRKY45基因出現(xiàn)高表達。

2.4 AP2/ERF類

AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子存在于所有的植物中，具有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域[87]。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子可以提高植物對病原菌的抗性。胡椒中AP2/ERF基因CaPF1在擬南芥中的過表達可以提高對植株丁香假單胞菌的抗性[88]。在煙草中過表達GmERF3基因可以激活植物PR基因的表達，提高對TMV等的抗性。

AP2/ERF的亞族DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物適應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用。擬南芥中的一些DREB基因如DREB1A/CBF3(A-1)基因過表達時可增強植株對干旱、高鹽和低溫的耐受性；過表達DREB2A(A-2)基因可顯著提高植物對干旱脅迫的抗性[89]。在遭遇不良環(huán)境脅迫時，羊草的LcDREB3a基因參與ABA和非ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達羊草LcDREB3a可提高抗旱和抗鹽能力[90]。

2.5 NAC類

NAC類轉(zhuǎn)錄因子N端存在一個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域[91]。對于NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗病防御反應(yīng)的調(diào)控作用，陳娜等[92]的研究發(fā)現(xiàn)，SmNAC基因的表達降低了茄子對青枯病的抗性，而且在SmNAC過表達的植株中，SA含量明顯低于正常植株，由此可以猜測SmNAC是通過抑制SA的合成降低了茄子對青枯病的抗性。Chen等[93]的研究則發(fā)現(xiàn)大麥中的轉(zhuǎn)錄因子HvNAC6可以增強大麥對白粉病的抗性。

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物對不良環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Mao等[94]在擬南芥中過表達TaNAC67基因后，發(fā)現(xiàn)植株對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受能力顯著增強。余海霞等[95]獲得了芒果轉(zhuǎn)錄因子基因MiNAC，并且利用熒光定量技術(shù)檢測了MiNAC基因在對植株低溫、高鹽和干旱脅迫處理后的表達，發(fā)現(xiàn)在3種脅迫下表達均顯著上調(diào)。

表2 植物中主要抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族

3 抗逆基因在藥用植物研究中的應(yīng)用

在藥用植物中有很大一部分為多年生植物，生長和發(fā)育易遭受生物和非生物脅迫，嚴重影響藥材質(zhì)量和產(chǎn)量[97]。藥用植物抗逆品種的選育是解決上述問題的重要方法和有效途徑[98]。近年藥用植物抗逆基因挖掘和抗逆分子機制解析，為抗逆基因在品種選育中的應(yīng)用打下堅實理論基礎(chǔ)。通過抗逆基因篩選抗逆品種，使抗性基因研究具有實際意義。由于藥用植物雜合度較高、生長周期較長、育種目標(biāo)特殊等原因，導(dǎo)致傳統(tǒng)育種方式周期長且效率較低。分子育種將現(xiàn)代分子生物技術(shù)運用到傳統(tǒng)育種方法中，使表型和基因型有機結(jié)合，具有快速、高效、準(zhǔn)確等特點，可顯著加快具有抗逆基因新品種的選育，保障和提升中藥材品質(zhì)[99]。

目前，隨著高通量測序技術(shù)的運用，基因組、轉(zhuǎn)錄組測序工作相繼展開，藥用植物遺傳信息的不斷挖掘，為抗逆基因的篩選提供了海量信息資源，為分子育種在藥用植物抗性品種選育中的運用奠定了基礎(chǔ)。分子育種主要包括分子標(biāo)記輔助育種、基因工程育種和分子設(shè)計育種[100]，其中分子輔助育種研究較深入且應(yīng)用較廣。藥用植物抗逆品種選育中，分子標(biāo)記輔助育種是利用分子標(biāo)記與抗性基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標(biāo)記來確定抗性基因是否存在，進而快速選擇具有抗性的目標(biāo)品種。分子標(biāo)記輔助育種是一種準(zhǔn)確性高、育種時間短的新型品種選育方法。

目前RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)、RAPD(隨機擴增多態(tài)性 DNA)、SNP(單核甘酸多態(tài)性)、SSR(簡單重復(fù)序列)、ISSR等各種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在藥用植物中的應(yīng)用已經(jīng)深入展開。各種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)都有優(yōu)缺點。例如：RAPD 需要DNA 量少、多態(tài)性高、實驗操作簡單，但不能區(qū)分顯性純合和雜合的基因型、結(jié)果的重復(fù)性差，而AFLP 則可靠、高效，但引物需要標(biāo)記、對技術(shù)與設(shè)備要求高、標(biāo)記分布不均勻。因此，應(yīng)根據(jù)具體選育的藥用植物品種合理靈活的選擇分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。例如，陳中堅等[101]利用DNA標(biāo)記輔助育種結(jié)合系統(tǒng)選育方法，培育出三七抗病新品種，該研究基于簡化基因組測序技術(shù)檢測出抗病群體的特異SNP 位點，利用與三七抗根腐病相關(guān)的SNP 位點篩選出抗病群體進而輔助系統(tǒng)選育，獲得的抗性新品種對根腐病致病菌F.oxysporum表現(xiàn)出明顯抗性，發(fā)病率顯著降低。李軍等[102]從西紅花球莖轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中進行SSR 信息分析并開發(fā)了SSR標(biāo)記。對丹參基因組的SSR、SRAP和ISSR等位點進行分析[103-104]，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜并開發(fā)了相應(yīng)引物[104]。這些分子遺傳標(biāo)記的開發(fā)為分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。目前，分子標(biāo)記輔助抗逆品種選育在農(nóng)作物中研究報道較多，但在藥用植物中進展緩慢，相關(guān)研究報道較少。分子標(biāo)記輔助育種是一種準(zhǔn)確性高、育種時間短的新型品種選育方法，能保障藥用植物在逆境中正常生長和發(fā)育，完成有效成分積累，具有廣闊的運用前景。

4 展望

藥用植物的藥材產(chǎn)量和品質(zhì)受到各種生物與非生物脅迫的影響，抗逆品種的選育就顯得尤其重要。分子育種作為一種高效、快速、準(zhǔn)確的新品種選育方法，是未來藥用植物育種的發(fā)展方向。雖然目前藥用植物的分子輔助育種已經(jīng)取得了明顯的進展，但是抗病蟲、抗環(huán)境脅迫等藥用植物分子輔助育種的進展仍然緩慢。這是由于現(xiàn)有遺傳連鎖圖譜和QTL定位結(jié)果大多源于一個或幾個親本組合，使得圖譜飽和度和QTL穩(wěn)定性較低，還難以應(yīng)用于藥用植物分子輔助育種實踐，尚需種質(zhì)驗證。簡化基因組測序技術(shù)可快速、高效構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜和篩選性狀相關(guān)標(biāo)記，為解決圖譜飽和度與精度較低問題提供良好解決途徑。除此之外，分子設(shè)計育種是一種綜合多學(xué)科、多層次信息的高效、精準(zhǔn)、預(yù)見性強的技術(shù)，可以很好滿足既培育藥用植物新品種又能確保藥材療效的要求。建立藥用植物分子設(shè)計育種技術(shù)體系，必將為藥用植物種質(zhì)創(chuàng)新帶來重大突破。因此，通過解析藥用植物的遺傳信息，挖掘出更多相關(guān)抗逆基因，對加快藥用植物抗逆新品種的選育，保障優(yōu)質(zhì)藥材的生產(chǎn)具有重要意義。