干擾EZH2表達(dá)對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞的輻射增敏作用及其機(jī)制研究

信 瑞，田建國，姜 民，曲丹華

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放射線科，吉林 長春130041；2.吉林省輻射環(huán)境監(jiān)督站，吉林 長春130000；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春 130021；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長春130041)

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，根據(jù)淋巴瘤的細(xì)胞起源可分為B細(xì)胞型、T細(xì)胞型和NK細(xì)胞型，其中70%患者為B細(xì)胞淋巴瘤[1]。長期以來，放射治療是大部分惰性淋巴瘤和預(yù)后較好的早期淋巴瘤的主要治療手段，對于部分化療抗拒的侵襲性淋巴瘤，放療也是其主要治療手段。而對高度惡性的淋巴瘤，放射治療僅能起到姑息治療或降低局部復(fù)發(fā)率的效果[2]，因此如何改善淋巴瘤的放療抗性是淋巴瘤研究的熱點(diǎn)之一。

Zeste同源物增強(qiáng)子2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2,PRC2)家族的成員之一，能通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)抑制基因轉(zhuǎn)錄[3]。EZH2在包括淋巴瘤[4]、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤[5]、乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、轉(zhuǎn)移性前列腺癌[8]等多種類型癌癥中過表達(dá)，并與腫瘤的增殖、侵襲、不良預(yù)后密切相關(guān)。本課題以非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤Ramos細(xì)胞為研究對象，采用shRNA技術(shù)干擾EZH2表達(dá)，觀察EZH2對Ramos細(xì)胞輻射敏感性的影響，初步探究其分子機(jī)制，以期為B細(xì)胞淋巴瘤的輻射增敏治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人B淋巴瘤Ramos細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞中心；RPMI-l640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；shEZH2和陰性shRNA購自廣州瑞博生物科技公司；lipofectamine TM2000試劑盒購自北京天根公司； Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和CCK8試劑盒購自南京建成生物科技公司；結(jié)晶紫購自北京索萊寶生物科技公司；Bax、Bcl2一抗購自美國Abcam公司； EZH2、p53及NF-kB一抗購自美國santa公司；羊抗兔二抗購自美國santa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染Ramos細(xì)胞培養(yǎng)于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)基。每2天更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞融合超過80%時(shí)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔5.0×105個(gè)細(xì)胞，按lipofeetamine TM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)置空白對照組、陰性shRNA組和shEZH2組。

1.3 照射方法采用GC3000 Elan輻射器(MDS Nordion,加拿大)，使用137Cs-ray放射源，源皮距為100 cm，活度為50.7E+12 Bq。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)期生長的細(xì)胞，接種于96-孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，在37℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，每組設(shè)5個(gè)平行。采用4 Gy γ-射線輻射處理，連續(xù)培養(yǎng)24-96 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl CCK8試劑，避光培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀測定在OD450 nm處各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至每孔5.0×105個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)平行。于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，孵育后給予0、2、4、6、8、10 Gy γ-射線輻射。輻射結(jié)束后于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 d，每3 d進(jìn)行一次換液。待細(xì)胞的單克隆集落形成后，甲醇固定并0.2%結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的單克隆數(shù)和單克隆直徑。采用多靶單擊模型繪制細(xì)胞存活曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)收集對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至每孔5.0×105個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)平行。于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，孵育后給予4 Gy γ-射線輻射。輻射結(jié)束后于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。細(xì)胞凋亡檢測使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，離心收集細(xì)胞，洗滌后分散于200 μl標(biāo)記緩沖液中。先加入10 μl Annexin V-FITC避光室溫反應(yīng)15 min，再加入0.05 g/L PI染液4℃避光染色5 min，最后使用流式細(xì)胞儀檢測，使用CellQuest3.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 western bloting收集經(jīng)過4 Gy γ-射線輻射的3組細(xì)胞，100 μl冰預(yù)冷的蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，離心收集上清液。使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，上樣20 μg蛋白行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，室溫條件下的封閉液中孵育30 min，與一抗室溫孵育60 min，洗膜后與二抗孵育60 min。顯色后的條帶使用Gel-Pro 凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描，使用Quantity One軟件分析光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Western bloting檢測shEZH2轉(zhuǎn)染前后EZH2蛋白表達(dá)水平變化shEZH2轉(zhuǎn)染48 h之后，shEZH2組相對于空白對照組和陰性shRNA組EZH2 蛋白表達(dá)量均顯著降低，差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003；P=0.004)，見圖1。

2.2 CCK8檢測對shEZH2對Ramos細(xì)胞體外增殖的影響shEZH2轉(zhuǎn)染后，shEZH2組細(xì)胞增殖速度降低并呈下降趨勢，其72 h、96 h細(xì)胞數(shù)目顯著低于對照組細(xì)胞(P=0.017;P=0.002)和陰性shRNA組(P=0.019;P=0.003)，干擾EZH2表達(dá)明顯抑制了Ramos細(xì)胞的增殖，見圖2。

圖1 shEZH2轉(zhuǎn)染對Ramos細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)的影響

注：1為空白對照組；2為陰性shRNA組；3為shEZH2組

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測shEZH2對Ramos細(xì)胞輻射敏感性的影響培養(yǎng)12 d時(shí)測定細(xì)胞克隆數(shù)目和克隆半徑，相對于陰性shRNA組，shEZH2組克隆數(shù)目和克隆半徑顯著降低(P=0.035；P=0.038)；當(dāng)聯(lián)合2 Gy γ-射線輻射時(shí)，shEZH2組克隆數(shù)目和克隆半徑進(jìn)一步降低，并顯著低于陰性shRNA組(P=0.027；P=0.031)，見圖3。用多靶單擊模型分析顯示shEZH2組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于空白對照組和陰性shRNA組(P=0.013；P=0.016)，Ramos細(xì)胞的SERDO值比為1.73，見表1。

圖2 shEZH2轉(zhuǎn)染對Ramos細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響

注：與陰性shRNA組相比*P<0.05；**P<0.01。

圖3 shEZH2轉(zhuǎn)染聯(lián)合γ-輻射對HeLa細(xì)胞克隆形成的影響

注：3A為克隆數(shù)目；3B為克隆直徑；1：空白對照組；2：陰性shRNA組；3：shEZH2組；4:空白對照組+γ-輻射；5：陰性shRNA組+γ-輻射；6：shEZH2組+γ-輻射；與陰性shRNA組相比*P<0.05；**P<0.01。

表1 Ramos細(xì)胞不同劑量γ線照射后單擊多靶模型擬合曲線參數(shù)

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化shRNA轉(zhuǎn)染后24 h后，shEZH2相對于空白對照組和陰性shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P=0.027；P=0.029)；協(xié)同給予γ-射線輻射處理后，shEZH2組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，顯著高于空白對照組和陰性shRNA組(P=0.016；P=0.017),見圖4。細(xì)胞周期分析顯示，給予輻射處理時(shí)陰性shRNA組G0+G1期占比為(57.43±5.82)%，S期占比為(24.63±3.56)%，G2期和M期占比為(17.94±2.17)%；而shEZH2組G0+G1期占比為(39.28±4.18)%,細(xì)胞占比明顯降低(P=0.016)，S期占比為(21.29±2.85)%，無明顯差異(P=0.025)，G2期和M期占比為(39.43±3.69)%，明顯升高(P=0.019)，產(chǎn)生了明顯的G2/M期細(xì)胞阻滯，見圖5。

圖4 shEZH2轉(zhuǎn)染聯(lián)合γ-射線輻射對Ramos細(xì)胞凋亡率的影響

注：相對于陰性shRNA組*P<0.05；**P<0.01

圖5 shEZH2轉(zhuǎn)染聯(lián)合γ-射線輻射對Ramos細(xì)胞細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞術(shù)分析(5A為空白對照組；5B為陰性shRNA組；5C為shEZH2組)

2.5 Western bloting檢測NF-κB通路蛋白表達(dá)的變化shRNA轉(zhuǎn)染后24 h后，shEZH2相對于陰性shRNA組細(xì)胞NF-kB、p53、Bax表達(dá)均顯著降低(P=0.008；P=0.025；P=0.014)；而Bcl-2表達(dá)卻顯著升高(P=0.035),見圖6。

圖6 shEZH2轉(zhuǎn)染聯(lián)合γ-射線對Ramos細(xì)胞Bcl-2、Bax、NF-kB、p53表達(dá)的影響

注1：空白對照組；2：陰性shRNA組；3：shEZH2組。

3 討論

惡性淋巴瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的淋巴造血系統(tǒng)疾病，放療是惡性淋巴瘤的傳統(tǒng)治療手段之一。隨著淋巴瘤病理分類的廣泛應(yīng)用，部分病理類型在腫瘤早期療效較好，而對于耐藥、復(fù)發(fā)的惡性病變當(dāng)前缺少合理的治療手段，并且20-30%的淋巴瘤患者放療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，提示淋巴瘤中存在輻射耐受現(xiàn)象[9]。

近年來，表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及侵襲中調(diào)控作用得到了臨床研究的廣泛關(guān)注。EZH2是PPC2家族的成員，是機(jī)體唯一的H3K27甲基化催化酶，與組蛋白甲基化修飾有關(guān)。人EZH2基因位于染色體的7q36.1，是一種進(jìn)化高度保守的基因，含有20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子，其編碼的產(chǎn)物能夠行使組蛋白賴氨酸N-端甲基轉(zhuǎn)移酶功能。EZH2能夠通過H3K27me3甲基化進(jìn)一步招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，也能通過H2AK119泛素化結(jié)合去乙?；?，通過組蛋白和DNA修飾干擾抑癌基因[10]。EZH2在細(xì)胞周期、細(xì)胞定向分化、細(xì)胞衰老和細(xì)胞復(fù)制方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，具有強(qiáng)大的促癌功能。EZH2在多種腫瘤組織中過表達(dá)，并且并與腫瘤的增殖、侵襲、不良預(yù)后密切相關(guān)[4-8]。Wagener[11]等收集了127例非霍奇金淋巴瘤組織樣本，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)EZH2陽性染色率高發(fā)89%，其中86%的樣本核染色強(qiáng)陽性，證實(shí)EZH2在淋巴瘤組織中異常表達(dá)。Velichutina[12]等研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在B淋巴細(xì)胞的發(fā)育早期發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，通過甲基化修飾調(diào)控免疫球蛋白IgH的重排，并且其高表達(dá)增加了淋巴瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。EZH2與多種腫瘤的侵襲性亞類群密切相關(guān)，被視為一種有潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)，但是其在淋巴瘤放射敏感性方面的影響尚未見報(bào)道。

本研究以人B淋巴瘤Ramos細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默EZH2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EZH2的沉默明顯降低了Ramos細(xì)胞的增殖能力，提示EZH2參與調(diào)控Ramos細(xì)胞增值活性，與先前報(bào)道中EZH2沉默抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖能力的結(jié)果類似。Cabrero[13]等應(yīng)用siRNA干擾了Namalwa、Ramos和naji 3種惡性淋巴瘤細(xì)胞系中EZH2表達(dá)，明顯降低3種細(xì)胞增值能力，并上調(diào)了NF-kB、HIF-α、IKK等蛋白的表達(dá)水平。并且克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示在γ-射線輻射條件下，EZH2的沉默明顯降低了Ramos細(xì)胞克隆形成能力，其放射增敏比為1.73，提示EZH2參與Ramos細(xì)胞輻射抗性的形成。

DNA斷裂損傷修復(fù)能力改變引發(fā)的細(xì)胞周期失控是淋巴瘤放療抗拒和放療失敗重要原因之一。EZH2在B淋巴祖細(xì)胞發(fā)育過程中廣泛表達(dá)，F(xiàn)ussbroich[14]研究發(fā)現(xiàn)在敲除EZH2的小鼠中，B細(xì)胞發(fā)育受阻， G1/S期細(xì)胞周期停滯，并產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈重排減少和早期淋巴細(xì)胞增殖缺陷。本研究中流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，給予γ-射線輻射處理時(shí)，EZH2沉默的Ramos細(xì)胞凋亡率明顯提高， G0/G1期占比為細(xì)胞占比明顯降低，S期占比無明顯差異， G2/M期占比明顯升高，這提示本研究中EZH2沉默使Ramos細(xì)胞積累在對放射相對敏感的G2/M期，提高了細(xì)胞凋亡水平。

NF-kB是一種具有特異DNA結(jié)合序列的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛參與細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)，能通過調(diào)節(jié)150多種效應(yīng)基因調(diào)節(jié)腫瘤的輻射敏感性[15]。在淋巴瘤等多種腫瘤中均存在NF-kB的表達(dá)活化，NF-KB的活化促進(jìn)淋巴組織不斷的增殖是淋巴瘤發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[16]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制EZH2顯著降低了NF-kB的表達(dá)。典型的衰老蛋白p53是NF-kB的下游靶蛋白，與細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等生命活動(dòng)密切相關(guān)，本研究中p53的表達(dá)同樣降低。Bcl-2和Bax是p53的下游靶基因， BCL-2的過量表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，延長腫瘤細(xì)胞生存，造成B細(xì)胞的累積和惡變， 高比率的Bcl-2/Bax能夠降低放療過程中腫瘤細(xì)胞凋亡，保護(hù)腫瘤細(xì)胞。本研究中抑制EZH2引發(fā)了Bcl-2和Bax表達(dá)改變，升高了Bcl-2/Bax比率，這提示EZH2沉默能抑制Ramos細(xì)胞中的NF-kB活化，并能進(jìn)而改變下游蛋白的表達(dá)，提高Ramos細(xì)胞輻射敏感性。

總之，本研究明確了EZH2在人B淋巴瘤細(xì)胞中的輻射增敏作用，其機(jī)制與細(xì)胞周期G2/M期細(xì)胞積累和調(diào)控NF-κB通路有關(guān)，為B細(xì)胞淋巴瘤的臨床靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。