組蛋白在膿毒癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞毒效應(yīng)中的作用研究

趙宏霞，梁奕洋，劉 瑜，余潔明，劉海英

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院PICU，深圳518028)

膿毒癥(Sepsis)是指疑似或證實感染引起的失控性全身炎癥反應(yīng)，是PICU最常見病種，也是導(dǎo)致患兒死亡的主要原因[1,2]。組蛋白是真核細(xì)胞中一類高度保守的蛋白質(zhì)，近年研究顯示游離組蛋白可與以TLR-4為主的多種TLR結(jié)合，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、免疫細(xì)胞快速凋亡等類內(nèi)毒素效應(yīng)，是膿毒癥始動和進展的重要因素[3,4]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)血清hH4與兒童膿毒癥疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后可能存在相關(guān)性[5]。本研究通過以不同濃度組蛋白刺激THP-1細(xì)胞，采集不同時間節(jié)點的上清液，測定其中炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β、IL-10、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 的含量，并對比用IgG及TLR-4抗體干預(yù)后，高濃度組蛋白組中上述細(xì)胞因子的變化，研究組蛋白對THP-1的作用及其可能機制；以TLR4抗體干預(yù)組蛋白環(huán)境中孵育的THP-1及HMEC，通過LDH水平及流式細(xì)胞計數(shù)評價組蛋白致細(xì)胞損傷及凋亡情況，對比未干預(yù)及IgG干預(yù)組，探討組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞的作用及其可能機制，并比較TLR-4抗體干預(yù)后THP-1上清細(xì)胞因子水平的變化率和凋亡細(xì)胞比例的變化率，研究TLR-4抗體在抗組蛋白致炎作用中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人單核細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司，小牛胸腺組蛋白購自瑞士Roche公司，鼠源IgG2b單克隆抗體及抗人TLR-4抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1組蛋白介導(dǎo)THP-1細(xì)胞因子產(chǎn)生作用研究

① 組蛋白刺激實驗

細(xì)胞饑餓后，將細(xì)胞分成對照組(細(xì)胞+10 μl/ml PBS)，低(10 μg/ml)、中(25 μg/ml)、高(50 μg/ml)實驗組，IgG干預(yù)組和TLR-4抗體干預(yù)組，各組在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h，分別收集第6、24 h上清液。

② 測定IL-1β、IL-10、TNF-a水平

各細(xì)胞因子水平檢測過程嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.2.2組蛋白致THP-1及HMEC損傷作用研究

① 組蛋白刺激(兩種細(xì)胞方法相同)及抗體干預(yù)

細(xì)胞饑餓后分為低對照組(僅細(xì)胞+無血清培養(yǎng)液)、高對照組(細(xì)胞+無血清培養(yǎng)液，后續(xù)加入2% Triton X-100)、組蛋白處理組(加入50 μg/ml組蛋白)、IgG處理組(加入50 μg/ml組蛋白+5 μg/ml IgG2b)、TLR-4抗體處理組(加入50 μg/ml組蛋白+5 μg/ml TLR4抗體)、空白對照組；各組繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，最后1 h在高對照組中加入Triton X-100，收集孵育后各組細(xì)胞上清液。

② 測定兩種細(xì)胞上清液LDH值

按LDH分析試劑盒說明操作。

③ 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

對各組細(xì)胞行Annexin V-FTTC/PI染色后以流式細(xì)胞儀檢測，步驟如下：收集各組細(xì)胞，PBS洗滌一次,重懸細(xì)胞后加入5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI染色液；充分混勻后室溫下避光染色15 min；補充緩沖液并上機分析各組凋亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)整理及分析應(yīng)用SPSS 23，圖表繪制釆用Prism 8.0，流式細(xì)胞檢測結(jié)果以Flowjo 10.4進行處理。THP-1細(xì)胞各實驗組細(xì)胞因子水平分別與對照組兩兩間比較采用Student’s t檢驗；LDH漏出率組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度組蛋白環(huán)境中THP-1上清液各細(xì)胞因子水平分析

與空白組比較，在加入外源性組蛋白處理的實驗組中，10 μg/ml處理組THP-1上清液中IL-1β水平無明顯變化，IL-10、TNF-α水平不同程度升高，差異顯著；25 μg/ml及50 μg/ml處理組中三種細(xì)胞因子水平均有不同程度升高，組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，其中IL-1β、IL-10濃度變化呈劑量及時間依賴性(見圖1)。

2.2 TLR-4及IgG抗體干預(yù)高濃度組后各細(xì)胞因子水平分析

加入IgG抗體的培養(yǎng)基培育6 h、24 h后THP-1細(xì)胞上清液中各炎癥因子水平與不含抗體的組別無顯著差異；加入TLR-4抗體組中各炎癥因子水平與較照組及IgG干預(yù)組相同時間節(jié)點所測炎癥因子水平均顯著下降(見表1)。

2.3 組蛋白體外細(xì)胞毒作用分析

與空白對照組比較，加入50 μg/ml外源性組蛋白處理后孵育24 h的THP-1及HMEC細(xì)胞上清液中LDH含量顯著升高，細(xì)胞凋亡比例也顯著升高；加入組蛋白及普通IgG的培養(yǎng)基中，細(xì)胞上清液LDH含量與單純加入組蛋白的實驗組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；與僅加入組蛋白的組別相比，同時加入組蛋白及TLR-4抗體的組別，LDH含量顯著降低，細(xì)胞凋亡比例亦顯著下降(見表2，圖2至圖3)。THP-1細(xì)胞組中，經(jīng)TLR-4抗體干預(yù)的與僅接受組蛋白刺激組比較，凋亡細(xì)胞比例的變化率高于細(xì)胞因子水平變化率(見表3至4)。

圖1 不同濃度組蛋白刺激后THP-1上清液中各細(xì)胞因子濃度變化

不同濃度組蛋白刺激6 h、24 h后TNF-α(圖A)、IL-10(圖B)水平均有顯著升高；10 μg/ml組蛋白刺激對IL-1β水平影響無統(tǒng)計學(xué)差異，25 μg/ml及50 μg/ml組蛋白IL-1β水平顯著升高(圖C)。各組以Student’st檢驗與對應(yīng)時點的對照組比較，*表示P<0.05，***表示P<0.001.

表1 不同干預(yù)條件下各細(xì)胞因子分泌水平(Mean±SD，pg/ml)

*表中P值為該組別與相同時間節(jié)點的對照組樣本比較結(jié)果，采用Student’sT檢驗

表2 不同干預(yù)條件下兩種細(xì)胞LDH漏出率(Mean±SD，%)

*P值為TLR-4抗體干預(yù)組與IgG干預(yù)組比較，采用Mann-WhitneyU檢驗，均為精確P值

3 討論

膿毒癥發(fā)生發(fā)展的過程復(fù)雜，其中內(nèi)皮細(xì)胞的活化與功能障礙是膿毒癥疾病發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。近年來，胞外組蛋白作為一種DAMPs，在全身性炎癥反應(yīng)綜合征中的重要作用逐漸被認(rèn)識。Xu等[3]通過一系列動物及離體細(xì)胞實驗，首次證實胞外組蛋白是導(dǎo)致膿毒癥加重、引起死亡的主要介質(zhì)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白可能從以下幾個方面參與該病理過程：①激活TLR：組蛋白可以與多種TLR結(jié)合，刺激下游的IL-1、IL-6等促炎性細(xì)胞因子釋放。研究提示TLR-4是組蛋白介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的主要受體[6]。Huang等[7]發(fā)現(xiàn)TLR-9是組蛋白誘導(dǎo)肝臟損害過程中的重要受體。②介導(dǎo)NOD-like receptor protein 3(NLRP3)炎性小體激活：NLRP3是高濃度組蛋白組細(xì)胞凋亡比例顯著高于空白對照組，加入TLR-4抗體的實驗組細(xì)胞凋亡比例較IgG組及高濃度組蛋白組比例顯著下降,與HMEC細(xì)胞組所顯示結(jié)果一致。

圖2 HMEC細(xì)胞Annexin V-FTTC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖

圖3 THP-1細(xì)胞Annexin V-FTTC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖

表3 TLR-4抗體處理24 h后THP-1細(xì)胞上清液各細(xì)胞因子變化率

表4 TLR-4抗體處理24 h后THP-1細(xì)胞凋亡率

NLRs家族的一員，與接頭蛋白形成蛋白-炎性小體復(fù)合物，后者既可進一步招募和結(jié)合多種炎癥相關(guān)分子,亦可增強半胱天冬酶-1(caspase-1)的活性。Caspase-1可使IL-1β前體活化為IL-1β，同時增加IL-18的分泌，二者均為強促炎癥因子[8]。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白可能通過NLRP3炎癥小體參與致炎過程[9]；③激活凝血系統(tǒng)：經(jīng)靜脈給予C57BL/6雄性小鼠純化組蛋白刺激后，小鼠的肺毛細(xì)血管床出現(xiàn)大量微血栓，繼而出現(xiàn)凝血功能障礙及右心衰竭，選擇性減少小鼠的血小板可延緩此過程，而為小鼠注射可中和外周游離組蛋白的重組血栓調(diào)節(jié)蛋白后，可減少新發(fā)血栓，降低死亡率[10]。

內(nèi)皮細(xì)胞承擔(dān)著凝血-纖溶系統(tǒng)平衡、調(diào)節(jié)體液免疫強度、抗炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，而細(xì)胞完整性是其實現(xiàn)上述功能的基礎(chǔ)。而組蛋白可直接損傷包括內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及組織。研究表明，細(xì)胞在凋亡階段中，包括組蛋白在內(nèi)的多種核內(nèi)物質(zhì)可被主動或被動地釋放至細(xì)胞外。Barrero等[11]發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺病患者肺內(nèi)凋亡的細(xì)胞周圍超乙酰化組蛋白H3.3含量顯著增加。組蛋白H3.3可結(jié)合于其他細(xì)胞表面，影響細(xì)胞鈣平衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體功能，損害微環(huán)境中其他的健康結(jié)構(gòu)細(xì)胞；Kawai等[12]發(fā)現(xiàn)，以不同劑量的純化組蛋白刺激健康小鼠后,血清組蛋白H3在肺部及肝臟毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布密度明顯較高，同時這些器官的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加并出現(xiàn)血漿成分外滲、凝血激活等與膿毒癥高炎癥反應(yīng)相似的現(xiàn)象，提示組蛋白對肺部及肝臟內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。

本研究中，HMEC在添加50 μl/ml組蛋白的混合培養(yǎng)液孵育24 h后，上清液中LDH水平均較空白對照組顯著升高，流式細(xì)胞術(shù)檢測的凋亡細(xì)胞比例較不含組蛋白培養(yǎng)基孵育的對照組顯著升高，提示離體環(huán)境下，組蛋白對HMEC和THP-1具有毒性作用；而同時加入抗TLR-4抗體的培養(yǎng)基中孵育的細(xì)胞，其上清液中LDH水平及凋亡細(xì)胞比例均顯著低于單純組蛋白干預(yù)組及普通IgG對照組，提示抗TLR-4抗體可拮抗組蛋白H4對內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

免疫細(xì)胞是機體實現(xiàn)免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，研究證實，組蛋白可以介導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化，從而激活MAPK途徑、引起線粒體損傷及caspase-3活化，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡。組織細(xì)胞及免疫細(xì)胞的短期內(nèi)大量凋亡均是膿毒癥疾病進展的重要原因。單核細(xì)胞是免疫細(xì)胞的另一重要組成部分，受病原體、內(nèi)毒素等活化后，單核細(xì)胞可以分泌TNF-α，IL-1β、IL-10等炎性因子，引起多種生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α，IL-1β等促炎性細(xì)胞因子可以正反饋激活單核細(xì)胞，抑制單核細(xì)胞的凋亡，延長單核細(xì)胞壽命[13]。然而，由于TNF-α與腫瘤壞死因子受體(tumor-necrosis-factor receptor，TNFR)結(jié)合后可招募相關(guān)效應(yīng)蛋白，激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)、MAPK等多條信號通路，引發(fā)巨噬細(xì)胞程序性壞死、單核細(xì)胞凋亡等多種炎性生物學(xué)效應(yīng)[14]，而膿毒癥早期的高炎癥反應(yīng)狀態(tài)下，TNFR被過度激活，TNF-α的細(xì)胞毒效應(yīng)被進一步放大，故TNF-α被認(rèn)為是膿毒癥疾病發(fā)生和進展的核心因素之一[15,16]。IL-10是主要由免疫細(xì)胞分泌的一類抑炎因子，可拮抗TNF-α，IL-1β等促炎因子，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，但已有研究證實，IL-10亦可通過激活caspase-8/FLICE通路[17]，介導(dǎo)單核細(xì)胞的凋亡。

本研究顯示，外源性組蛋白干預(yù)可刺激單核細(xì)胞活化，增強其分泌與膿毒癥起病、進展密切相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β及IL-10的能力，表現(xiàn)出與內(nèi)毒素類似的作用，且該作用具有劑量依賴性，TLR-4抗體可使上述細(xì)胞因子的分泌水平顯著下降，表現(xiàn)出拮抗組蛋白促炎效應(yīng)的作用，與既往研究結(jié)果一致；經(jīng)50 μg/ml組蛋白刺激后，單核細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH漏出率及凋亡細(xì)胞比例亦顯著升高，提示組蛋白對單核細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)與其對內(nèi)皮細(xì)胞相似。加入TLR-4抗體后LDH漏出率及凋亡細(xì)胞比例顯著降低，提示TLR-4抗體亦可拮抗組蛋白H4對單核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，外源性組蛋白對單核細(xì)胞的激活作用可能是其導(dǎo)致膿毒癥進展的重要原因之一，與對內(nèi)皮細(xì)胞的作用機制類似，TLR-4受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為組蛋白對單核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用途徑之一。與僅含組蛋白的對照組比較，加入TLR-4抗體的實驗組凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞因子水平均顯著下降，且凋亡細(xì)胞比例的變化率較細(xì)胞因子水平的變化率大，提示TLR-4抗體可能主要通過拮抗組蛋白的細(xì)胞毒效應(yīng)發(fā)揮抗炎作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，THP-1細(xì)胞孵育24 h后采集的上清液中，TNF-α濃度較第6小時樣本出現(xiàn)顯著下降，另兩種細(xì)胞因子無此現(xiàn)象，與早前文獻報道結(jié)果一致，此結(jié)果仍需進行大樣本研究。

本研究可得出以下結(jié)論：①離體環(huán)境下組蛋白可以活化單核細(xì)胞，增加TNF-α、IL-1β、IL-10等細(xì)胞因子的分泌，該作用呈劑量依賴性；②離體環(huán)境下組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用，且該作用可被抗TLR-4抗體拮抗，提示胞外組蛋白可能通過TLR-4途徑在膿毒癥的起病及進展過程中發(fā)揮作用。③TLR-4抗體可能主要通過拮抗組蛋白的細(xì)胞毒效應(yīng)發(fā)揮抗炎作用。后續(xù)將繼續(xù)研究組蛋白促炎反應(yīng)過程中的其他可能作用位點，為加深對膿毒癥的認(rèn)識、提高臨床診斷水平及研究更有針對性的治療方案提供理論依據(jù)。