推拿手法對(duì)家兔骨骼肌失神經(jīng)支配后成肌調(diào)節(jié)因子Myf-5、Myogenin 表達(dá)的影響

盧裕強(qiáng) 郭汝寶

周圍神經(jīng)損傷是指周圍神經(jīng)神經(jīng)干或分支受到損害后，引起軀體感覺(jué)障礙、運(yùn)動(dòng)功能減退等癥狀的一類病癥，臨床常見(jiàn)、多發(fā)[1]。但神經(jīng)和骨骼肌變性萎縮的機(jī)理復(fù)雜，目前臨床上對(duì)受損神經(jīng)、肌肉的再生修復(fù)缺少有效的治療手段[2]。推拿是中醫(yī)重要組成部分之一，有疏通經(jīng)絡(luò)、舒筋止痛等功效，廣泛應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷、肌萎縮等疾病，取得較好的臨床效果[3]。本課題組既往研究表明，推拿手法作用于骨骼肌失神經(jīng)支配模型家兔，可改善患肌的肌電生理及收縮功能，延緩骨骼肌萎縮[4]。本次研究擬通過(guò)推拿手法作用于骨骼肌失神經(jīng)支配家兔，觀察骨骼肌失神經(jīng)支配后肌組織成肌調(diào)節(jié)因子中生肌因子5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌細(xì)胞生成素（Myogenin）表達(dá)水平，研究推拿手法對(duì)失神經(jīng)支配后骨骼肌萎縮修復(fù)的可能作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3 月齡普通級(jí)新西蘭雄性家兔120 只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，每只體質(zhì)量2～2.5kg，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，環(huán)境溫度20～23℃，濕度30%～100%，光照150～200Lx，噪音小于50dB，許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0004。

1.2 試劑與儀器 注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（201412086，舒泰神生物制藥公司）、Trizol Reagent（15596-026，美國(guó)Invitrogen 公司）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622，美國(guó)Thermo 公司）、FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（04913914001，瑞士Roche 公司）、引物（美國(guó)Invitrogen 公 司）。Myf-5引物序列參數(shù)：上游5＇-GAGGGTGAGTTTGGGGACGA-3＇，下游5＇-TAGCGGATGGCATTCCTGAG-3＇；Myogenin 引物序列參數(shù)：上游5＇-CCACAACCTGCACTCCCTCA-3＇，下游5＇-CAGTTGGGCATGGTTTCATCG-3＇；內(nèi)參GAPDH 引物序列參數(shù)：上游5＇-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3＇，下游5＇-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3＇。多樣品研磨珠均質(zhì)儀（Bead Ruptor 12，美國(guó)Omni 公司）、熒光定量PCR 儀（7300，美國(guó)ABI 公司）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州蘇凈安泰公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備 新西蘭家兔120 只適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）治療組、手法治療組，每組30 只。為了對(duì)檢測(cè)指標(biāo)做一連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察，以及與本課題組既往研究相延續(xù)[4]，每組再隨機(jī)分為五個(gè)亞組：2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月、4 個(gè)月組，每個(gè)亞組6 只家兔。模型對(duì)照組、NGF治療組、手法治療組家兔均進(jìn)行右后肢脛神經(jīng)切斷操作，建立腓腸肌失神經(jīng)支配模型[5]。具體操作：3%戊巴比妥鈉溶液，家兔按0.7mL/kg 體質(zhì)量，緩慢推注入耳緣靜脈進(jìn)行麻醉，將家兔在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上固定，右后肢剃毛并暴露大腿后部和腘窩。消毒后于膝上股后外側(cè)切開小口，暴露并使用玻璃分針鈍性分離脛神經(jīng)，其后于脛神經(jīng)上端處切斷脛神經(jīng)干，且將近端脛神經(jīng)的游離斷向上折返縫入股二頭肌內(nèi)。逐層縫合切口后，于切口附近注射青霉素預(yù)防感染。左后肢不做任何處理。正常對(duì)照組家兔僅于右后肢膝上股后外側(cè)做同樣大小切口，暴露脛神經(jīng)，不做切斷處理，消毒縫合切口同前。

2.2 干預(yù)措施（1）手法治療組：推拿干預(yù)手法為按揉法，與本課題組既往的規(guī)范操作一致[4]。手法的輕重、頻率均需通過(guò)FZ-I 型推拿手法測(cè)力分析儀標(biāo)定，專人經(jīng)訓(xùn)練之后，于手法組家兔術(shù)側(cè)腓腸肌上進(jìn)行操作。具體操作方法：家兔經(jīng)兔用固定器固定，雙后肢伸出，操作者一手固定其右下肢，暴露腓腸肌部位，另一手置于腓腸肌上，沿著腓腸肌走行，給予按揉手法操作。按揉法的參數(shù)：壓力19.6N、頻率140次/min，每次10min，每天1 次，于造模后第4 天開始進(jìn)行手法干預(yù)。（2）NGF 治療組：注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子30μg 溶于2mL 注射用水后，家兔右后肢腓腸肌肌肉注射，于造模后第4 天開始，每天1 次，持續(xù)3周。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組同樣使用兔用固定器固定10min，但不進(jìn)行其他操作。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 各亞組分別在各自對(duì)應(yīng)的造模后第2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月、4 個(gè)月取材。（1）計(jì)算肌濕重比：將家兔過(guò)度麻醉后，沿股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)至跟骨結(jié)節(jié)止點(diǎn)完整剝?nèi)‰p側(cè)腓腸肌，電子天平稱量肌肉濕重，計(jì)算術(shù)側(cè)與健側(cè)的比值，即為肌濕重比。（2）實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time PCR）法檢測(cè)腓腸肌中Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 表達(dá)水平：快速取右后肢腓腸肌肌腹處1.0cm×1.0cm×0.5cm 肌肉組織1塊，冷凍管內(nèi)保存，液氨速凍后置于低溫冰箱（-80℃）中保存。提取肌組織總RNA（標(biāo)本排序；加入600μL Trizol 預(yù)冷；勻漿加入氯仿混勻；離心；取無(wú)機(jī)層，加入異丙醇混勻；離心后，棄上清液；用乙醇洗滌沉淀；離心3000r，2min，取沉淀；烘干；溶解RNA 保存），之后逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并計(jì)算Myf-5 mRNA、Myogenin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。采用儀器自帶軟件（ABI Prism 7000 SDS Software）記錄分析數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 推拿手法對(duì)家兔失神經(jīng)支配后腓腸肌肌濕重的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時(shí)間點(diǎn)腓腸肌肌濕重比均下降（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月，手法治療組在造模后第2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月、4 個(gè)月時(shí)，腓腸肌肌濕重比高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。手法治療組在造模后第2 周、3 周時(shí)腓腸肌肌濕重比低于NGF 治療組，4 個(gè)月時(shí)則高于NGF 治療組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3.2 推拿手法對(duì)家兔失神經(jīng)支配后腓腸肌組織Myf-5 mRNA 表達(dá)的影響 模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時(shí)間點(diǎn)腓腸肌Myf-5 mRNA表達(dá)均較正常對(duì)照組升高（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月，手法治療組在造模后第2 周時(shí)，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達(dá)低于模型對(duì)照組；手法治療組在造模后第1、2、4 個(gè)月時(shí)，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達(dá)高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。手法治療組在造模后第3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月、4 個(gè)月時(shí)，腓腸肌Myf-5 mRNA 表達(dá)高于NGF 治療組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 推拿手法對(duì)家兔失神經(jīng)支配后腓腸肌Myogenin mRNA 表達(dá)的影響 模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔各時(shí)間點(diǎn)腓腸肌Myogenin mRNA 表達(dá)均較正常組升高（P＜0.05）。NGF 治療組在造模后第2 周、3 周、1 個(gè)月、4 個(gè)月，手法治療組在造模后第4 個(gè)月時(shí)，腓腸肌Myogenin mRNA 表達(dá)低于模型對(duì)照組，手法治療組在造模后第2 個(gè)月時(shí)高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。干預(yù)2 周、3 周、1 個(gè)月、2 個(gè)月后，手法治療組腓腸肌Myogenin mRNA 表達(dá)均高于NGF 治療組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌肌濕重比比較（%，）

表1 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌肌濕重比比較（%，）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進(jìn)行右后肢脛神經(jīng)切斷操作，手法治療組進(jìn)行推拿干預(yù)，NGF 治療組肌注注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子

表2 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌組織Myf-5 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌組織Myf-5 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進(jìn)行右后肢脛神經(jīng)切斷操作，手法治療組進(jìn)行推拿干預(yù)，NGF 治療組肌注注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子；Myf-5：生肌因子5

表3 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌組織Myogenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組失神經(jīng)支配家兔腓腸肌組織Myogenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05；與NGF 治療組比較，▲P＜0.05；模型對(duì)照組、NGF 治療組、手法治療組家兔均進(jìn)行右后肢脛神經(jīng)切斷操作，手法治療組進(jìn)行推拿干預(yù)，NGF 治療組肌注注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子；Myogenin：肌細(xì)胞生成素

4 討論

失神經(jīng)支配之后骨骼肌萎縮較迅速，而神經(jīng)再生較緩慢，往往骨骼肌在神經(jīng)再支配前已基本喪失細(xì)胞再生的物質(zhì)基礎(chǔ)，導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)后肌肉功能難以恢復(fù)[6]。因此，保存失神經(jīng)支配骨骼肌的再生活性，防止其不可逆變性萎縮，是解決失神經(jīng)支配骨骼肌重獲神經(jīng)支配后有效功能康復(fù)的重要環(huán)節(jié)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)損傷后，局部組織通過(guò)推拿手法干預(yù)，發(fā)生了一系列關(guān)節(jié)、肌肉的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，一方面促進(jìn)了局部的淋巴、血液循環(huán)，改善組織炎性水腫、瘢痕粘連，從而防止被損傷肌肉、韌帶、關(guān)節(jié)囊的攣縮[8]；另一方面，通過(guò)有規(guī)律被動(dòng)性收縮，局部肌肉興奮，肌組織代謝增強(qiáng)、有害代謝物堆積減少，從而改善失神經(jīng)后萎縮的骨骼肌組織的代謝過(guò)程，同時(shí)也促進(jìn)了一系列肌源性生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生及骨骼肌再生分化，使肌組織纖維化進(jìn)程得到控制，延緩廢用性萎縮的發(fā)生[9-10]。與此同時(shí)，骨骼肌再生是一個(gè)大量神經(jīng)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等共同參與的高度動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，其中NGF 是最早被發(fā)現(xiàn)，也是非常典型的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是目前臨床上周圍神經(jīng)損傷后常用的內(nèi)科治療手段，在臨床及科研上均取得了一定的療效[11-12]，因此本實(shí)驗(yàn)也將NGF 作為手法治療的一個(gè)對(duì)照。

周圍神經(jīng)重度損傷后其支配的骨骼肌迅速萎縮并失去收縮功能，最突出的癥狀是肌肉萎縮；肌濕重是實(shí)驗(yàn)中常用于觀察骨骼肌萎縮情況的一項(xiàng)宏觀指標(biāo)。以往本課題組的研究觀察到，周圍神經(jīng)切斷損傷后，相關(guān)骨骼肌肌濕重迅速出現(xiàn)下降，隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)而下降速度趨緩[13]。本研究同樣觀察到，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組干預(yù)2 周時(shí)，腓腸肌肌濕重比已下降顯著（P＜0.05），表明家兔行脛神經(jīng)切斷術(shù)后，腓腸肌失去神經(jīng)支配，萎縮明顯，達(dá)到了我們研究時(shí)需要觀察損傷神經(jīng)修復(fù)與萎縮骨骼肌修復(fù)兩個(gè)方面的需求；3 周后肌濕重比下降趨勢(shì)變緩，與既往研究相近。與模型對(duì)照組相比，NGF 及手法治療組各時(shí)間點(diǎn)肌濕重比值為高（P＜0.05），表明經(jīng)NGF、推拿手法干預(yù)可減輕失神經(jīng)骨骼肌的萎縮。另一方面，手法治療組4 個(gè)月時(shí)顯著高于NGF 治療組（P＜0.05），這表明手法治療的遠(yuǎn)期療效好于NGF 治療。

肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌再生的關(guān)鍵。肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、激活、成肌分化受到成肌調(diào)控因子、生長(zhǎng)因子、激素等多因素的影響[14]。其中成肌調(diào)節(jié)因子由Myogenin、Myf-5、肌分化因子（MyoD）等組成[15]。其中肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化主要受骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Myogenin 等的調(diào)節(jié)，與Myogenin 參與成肌細(xì)胞融合、形成肌管的過(guò)程有關(guān)[16-17]。而Myf-5 屬成肌決定因子，位于Myogenin 的上游，主要存在于靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞，肌組織受損后，靜默狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞開始激活并表達(dá)Myf-5，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)并自我激活和相互激活，具體可能與調(diào)節(jié)肌纖維的生長(zhǎng)相關(guān)[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨骼肌失神經(jīng)損傷后，肌組織的Myf-5 和Myogenin 含量均早期開始升高，表明Myf-5 和Myogenin 早期參與了骨骼肌失神經(jīng)支配損害后的動(dòng)態(tài)調(diào)控，與其他學(xué)者研究一致[19-20]。NGF 治療組Myf-5 和Myogenin mRNA 表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均低于模型對(duì)照組，而肌濕重在中遠(yuǎn)期改善均明顯，可能與通過(guò)外源性提供NGF 而促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)再支配有關(guān)，從而改善肌萎縮相關(guān)，與既往他人研究失神經(jīng)支配后肌組織內(nèi)NGF 開始顯著下降，通過(guò)外源性提供NGF 可改善神經(jīng)及肌組織功能一致[21]。手法治療組Myf-5 mRNA 在2 周低于模型對(duì)照組，第3 周顯著升高，在1、2、4 個(gè)月高于模型對(duì)照組，表明手法在早期抑制Myf-5 表達(dá)，中期開始促進(jìn)其表達(dá)，Myogenin mRNA 在2 個(gè)月高于模型對(duì)照組，在4個(gè)月低于模型組，表明推拿手法可以促進(jìn)Myogenin mRNA 在后期的表達(dá)。而Myogenin 位于Myf5 的下游，既往研究表明，myogenin 表達(dá)升高有利于骨骼肌接受神經(jīng)再支配，在接受神經(jīng)再支配后骨骼肌功能恢復(fù)較良好[22]。結(jié)合既往本課題組發(fā)現(xiàn)手法治療可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化，以及本次手法在早中期改善Myf-5 表達(dá)峰期，后期改善Myogenin 表達(dá)[23]。這提示手法干預(yù)可能使得Myf-5 表達(dá)高峰后延且后期持續(xù)增高，從而避免肌衛(wèi)星細(xì)胞的早期非神經(jīng)性無(wú)效增殖，而在后期Myogenin 的顯著升高，也更為骨骼肌的再生保留了活力。這種機(jī)制與NGF 改善失神經(jīng)骨骼肌萎縮的機(jī)制存在不同，因此也可解釋為何手法組及NGF 組均取得了療效，但對(duì)于Myf-5、Myogenin 的改變卻不相同。

綜上所述，推拿手法改善成肌調(diào)節(jié)因子Myf-5、Myogenin 的表達(dá)可能是手法改善失神經(jīng)支配骨骼肌功能的機(jī)制之一，但推拿手法對(duì)于延緩肌萎縮的具體作用靶點(diǎn)仍需未來(lái)進(jìn)一步研究。