基于腸道菌群結(jié)構(gòu)特征研究胰腺癌不同中醫(yī)證型與預(yù)后的相關(guān)性

陳 卓 錢 祥 張愛琴 傅曉璇 甄宏德

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）生長迅速，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，具有臨床表現(xiàn)隱匿、預(yù)后極差的特點(diǎn)[1]。胰腺癌確診時已為晚期的患者術(shù)后1 年生存率為30%～40%，2 年生存率不足20%，5 年生存率僅為5%左右[2]。近年來，中醫(yī)在惡性腫瘤治療中的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，已成為胰腺癌的重要治療手段[3]。

“辨證論治”是中醫(yī)治療胰腺癌的理論核心。隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)、腸道微生態(tài)方面研究的發(fā)展，為胰腺癌證候的研究提供新的技術(shù)平臺。本文旨在利用現(xiàn)代生物手段分析胰腺癌不同中醫(yī)證型腸道菌群結(jié)構(gòu)特征及總生存期差異，探究兩者間的內(nèi)在聯(lián)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 抽取2018 年1 月1 日—2018 年9月30 日在浙江省腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤放療科及腹部腫瘤內(nèi)科收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的胰腺癌患者36 例，根據(jù)中醫(yī)證型分為氣血瘀滯組12 例、脾虛濕熱組11例及濕熱內(nèi)蘊(yùn)組13 例。另設(shè)浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生正常健康人群8 名作為健康對照組。本臨床研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核通過，倫理批件號為IRB-2018-194。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）胰腺癌患者入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70 歲；經(jīng)組織病理學(xué)和（或）細(xì)胞學(xué)證實(shí)為胰腺癌[4]的患者；非其他部位腫瘤轉(zhuǎn)移至胰腺部；符合中醫(yī)辨證分型[5]為濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、氣血瘀滯證及脾虛濕熱證之一的患者；簽署知情同意書。（2）正常健康人群入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70 歲；無消化道、心腦血管或其他主要臟器系統(tǒng)的病史；近1 個月內(nèi)無胃腸病史，無腹瀉、無應(yīng)用抗生素等藥物及服用腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑；無吸煙、飲酒等嗜好；舌質(zhì)淡紅苔薄白，脈象正常。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）合并心、腦、肝、腎或造血系統(tǒng)等重大內(nèi)科疾病患者；（2）患有精神疾病患者。

1.4 退出標(biāo)準(zhǔn)（1）患者依從性差，自行要求終止試驗；（2）中醫(yī)證型改變。

1.5 中醫(yī)辨證分型 中醫(yī)辨證分型參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]分為三型：氣血瘀滯證、脾虛濕熱證及濕熱內(nèi)蘊(yùn)證。（1）氣血瘀滯證：左上腹部疼痛明顯，痛有定處，呈刺痛或脹痛，腹痛可隨情緒變化而有所增減，或夜間痛甚，痞塊疼痛拒按，舌紫暗或有瘀斑、瘀點(diǎn)，苔薄，脈弦或細(xì)澀；（2）脾虛濕熱證：消瘦，神疲乏力，胃納不佳，腹脹，食后尤甚，便溏甚或如水樣，身體困重，身熱不揚(yáng)，舌淡胖，苔黃滑，脈濡而無力；（3）濕熱內(nèi)蘊(yùn)證：脘腹脹悶，惡心納呆，口黏不爽，渴不多飲，小便短黃，大便干結(jié)或黏滯，或見面目發(fā)黃色鮮明，或有身熱不揚(yáng)，汗出熱不解，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。中醫(yī)證型由三名副主任及以上中醫(yī)師確認(rèn)。

1.6 儀器及試劑 KAPA HiFiHotstartReadyMix PCR kit 高保真酶（Kapa Biosystems，KK2602），離心機(jī)（XiangYi H1650-W），Light Cycler 96 PCR 儀（Roche，Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（Life Technologies），電泳儀（Tanon，DYY-6C）凝膠成像儀（Tanon），NanoDrop 2000 Spectrophotometer（Thermo Scientifc)，Qubit2.0 Fluorometer（Invitrogen），2100 Bioanalyzer（Agilent），Miseq Reagent Kit PE300 v3 試劑盒（Illumina，MS-102-3003），QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒（Qiagen，51604），AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen，ASJ0013），Illumina HiSeq2500 PE250 高通量測序儀（Illumina，Inc，CA，USA），含Qiime 分析軟件（Qiime1.9.1）的計算機(jī)（Dell）等。

1.7 檢測方法 采集受試者糞便，經(jīng)處理后，進(jìn)行基因組DNA 提取和質(zhì)檢，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物純化，用Illumina HiSeq PE250 平臺進(jìn)行16S rDNA 測序。

Usearch 聚類時，根據(jù)豐度從大到小先將序列進(jìn)行排序，然后通過97%的相似度聚類，得到OTU。將OTU 與RDP 數(shù)據(jù)庫比對，對每個OTU 進(jìn)行物種分類，得到物種豐度表，進(jìn)行后續(xù)分析。根據(jù)每個樣本文庫中的OTU 豐度信息，使用Shannon Index 和稀疏性曲線來評估文庫的多樣性，使用Qiime 軟件來計算Shannon Index，使用aRarefactWin 軟件來計算稀疏性曲線。各樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異采用Unweighted Unifrac PCoA 法分析。

1.8 隨 訪 隨訪患者，統(tǒng)計其總生存時間，生存起始時間為首次經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)病理證實(shí)為胰腺癌的時間，終點(diǎn)時間為患者死亡，隨訪結(jié)束即截尾時間為2019 年2 月1 日。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。滿足正態(tài)分布，方差齊性的定量資料用獨(dú)立樣本t 檢驗。不滿足正態(tài)分布的資料用非參數(shù)檢驗。使用秩和檢驗方法對不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析，找出對組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的物種，采用R 語言stats 包的kruskal.test 函數(shù)找出不同組間有明顯差異的物種。用Log rank 法比較不同組間總生存時間的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌不同中醫(yī)證型患者一般資料比較 收集胰腺癌患者36 例，排除或退出共8 例，最終納入28例，其中氣血瘀滯組9 例，脾虛濕熱組9 例，濕熱內(nèi)蘊(yùn)組10 例。胰腺癌不同中醫(yī)證型患者在性別、年齡、分期等一般資料上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰腺癌不同中醫(yī)證型患者一般資料比較

2.2 OTU 韋恩圖分析 本研究中36 個樣品（氣血瘀滯組、脾虛濕熱組、濕熱內(nèi)蘊(yùn)組及健康對照組各含樣品9、9、10、8 個）共產(chǎn)生796 個OTU。四組之間相似的OTU 占30%，四組共有的OTU 為241 個。不同組間也確實(shí)存在一些OTU 是其他組所沒有的，初步說明胰腺癌不同中醫(yī)證型患者及健康對照組四組之間OTU 具有一定的差異。

圖1 OTU 韋恩圖

2.3 物種組成分析 氣血瘀滯組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），普氏菌屬（Prevotella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium），羅斯氏菌屬（Roseburia）；脾虛濕熱組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），鏈球菌屬（Streptococcus），埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella），普氏菌屬（Prevotella）；濕熱內(nèi)蘊(yùn)組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），梭菌屬XIVa（ClostridiumXIVa）；健康對照組豐度最高的前5 個屬依次是擬桿菌屬（Bacteroides），普氏菌屬（Prevotella），普拉梭菌屬（Faecalibacterium），羅斯氏菌屬（Roseburia），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。

圖2 不同分組屬水平上物種豐度組成柱狀圖

2.4 差異物種分析 組間差異性物種分別是產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、氣球菌屬（Anaerococcus）、奇異菌屬（Atopobium）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、柯林斯氏菌屬（Collinsella）、鐮刀菌屬（Fusicatenibacter）、孿生球菌屬（Gemella）、芽殖菌屬（Gemmiger）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、分枝桿菌屬（Mogibacterium）、臭桿菌屬（Odoribacter）、錐體菌屬（Pyramidobacter）、羅氏菌屬（Roseburia）、茄桿菌屬（Solobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus），見表2。

2.5 總生存期差異分析 用Log rank 法比較胰腺癌三種中醫(yī)證型的總生存期差異，結(jié)果顯示，脾虛濕熱組的中位生存時間為8 個月（95%置信區(qū)間：4.167-11.833），比氣血瘀滯組的12 個月（95%置信區(qū)間：8.013-15.987）和濕熱內(nèi)蘊(yùn)組的18 個月（95%置信區(qū)間：5.658-30.342）都要短。三組的總生存期差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.092，P=0.029），具體而直觀的生存曲線圖。

圖3 生存曲線圖

3 討論

胰腺癌在古籍文獻(xiàn)中雖未見直接記載，但根據(jù)其臨床特點(diǎn)，可歸于中醫(yī)“伏梁”“積聚”“腹痛”“黃疸”等范疇[6]。胰腺癌的臨床表現(xiàn)主要有腹痛、黃疸、消瘦、乏力以及食欲不振、腹脹、便秘或腹瀉等消化系統(tǒng)的癥狀。對胰腺癌病因病機(jī)的認(rèn)識，則不外乎內(nèi)因（飲食不節(jié)、情志失度、病久虛損等）、外因（濕熱侵襲等）兩方面多因素復(fù)雜作用的結(jié)果[7]。關(guān)于胰腺癌的中醫(yī)辨證分型，由于各醫(yī)家所處氣候、地域、生活習(xí)慣、風(fēng)俗文化等的差異，及對胰腺癌病因病機(jī)的認(rèn)識和臨床經(jīng)驗的不同，目前尚無統(tǒng)一的辨證標(biāo)準(zhǔn)。金莉[5]通過回顧胰腺癌中醫(yī)治療的病因病機(jī)、試驗研究和臨床觀察，總結(jié)了近十年來多位臨床醫(yī)家的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、氣血瘀滯證和脾虛濕熱證為胰腺癌的常見證型。這一結(jié)果與我們臨床觀察基本相符合，故我們將胰腺癌病人大致分為這三種證型。

近期大量論文和綜述涵蓋了包括肥胖、糖尿病、炎癥性腸病、肝病、心臟代謝紊亂、神經(jīng)退行性疾病及癌癥在內(nèi)的疾病，都存在著腸道微生物群的變化[8-13]。本研究的胰腺癌三種不同中醫(yī)證型中，脾虛濕熱組中的纖毛菌屬（Leptotrichia）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、奇異菌屬（Atopobium）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）以及鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度較高（屬于脾虛濕熱組的差異物種），而在濕熱內(nèi)蘊(yùn)組中的相對豐度則最低（除彎曲桿菌屬外）。Ren等[14]首次通過MiSeq 測序方法分析了中國胰腺癌患者的腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，彎曲桿菌屬（Campylobacter）和纖毛菌屬（Leptotrichia）在胰腺癌患者的糞便微生物中顯著富集。此外，比較胰頭癌伴膽總管阻塞患者組和胰頭癌不伴有膽總管阻塞患者組的腸道微生物發(fā)現(xiàn)，胰頭癌患者組較胰體胰尾癌患者組的鏈球菌屬（Streptococcus）豐度顯著增加，提示了鏈球菌屬（Streptococcus）與腸道中的膽汁酸和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。胰腺癌腸道菌群結(jié)構(gòu)特征尚未見更多報道。然而，口腔微生物群與消化道微生物群重疊，并可通過循環(huán)轉(zhuǎn)移至胰腺[15]。有學(xué)者使用16S rDNA 測序技術(shù)來研究胰頭癌患者的舌苔微生物群結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，胰頭癌患者的舌苔菌群多樣性顯著增加，主成分分析顯示患者的舌苔菌群組成與健康人具有顯著性差異，其中纖毛菌屬（Leptotrichia）、奇異菌屬（Atopobium）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）等13 個菌屬在胰頭癌患者的舌苔菌群中顯著增加[16]。James Farrell 等[17]將胰腺癌患者組和健康對照組的唾液微生物群進(jìn)行綜合比較，發(fā)現(xiàn)與所有非癌癥受試者相比，胰腺癌患者的顆粒鏈菌屬（Granulicatella）中的Granulicatella adiacens 水平顯著升高，流行病學(xué)研究表明口腔炎癥（牙周炎）與胰腺癌發(fā)展的風(fēng)險增加呈正相關(guān)[18]。鏈球菌屬（Streptococcus）的牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、溶血鏈球菌（Streptococcus gallolyticus subsp.）和巴氏桿菌（Pasteurianus）引起的菌血癥和胰腺癌之間有關(guān)聯(lián)，但仍有待進(jìn)一步的研究[19-20]。其余的菌屬暫未發(fā)現(xiàn)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的特異性和顯著相關(guān)性。

表2 差異顯著物及其豐度均值列表

腸道微生態(tài)也是一個陰陽平衡的整體。腸道菌群可以分為對人體有益的細(xì)菌和有害的細(xì)菌，在正常情況下，人體內(nèi)兩者處于相對平衡的狀態(tài)，若兩者比例失調(diào)則會導(dǎo)致腸道微生態(tài)的紊亂從而致病。從中醫(yī)學(xué)角度來看，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證以濕熱之邪實(shí)為主要矛盾，體內(nèi)正氣并未虧虛，正氣尚能抵御外邪之?dāng)_，故而體內(nèi)腸道的腸道微生態(tài)尚能維持相對平衡，此證型與健康人群腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)最為接近（韋恩圖中交集最多）。而脾虛濕熱證患者雖有濕熱之表象，但其病機(jī)的根本卻是久病或攻伐消癥后中焦脾胃之氣漸耗，以體內(nèi)正氣虛衰為主要矛盾，正虛則無以抵抗外邪，故而體內(nèi)腸道的腸道微生態(tài)出現(xiàn)失衡，與健康人群腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大（韋恩圖中交集最少）。胰腺癌三種中醫(yī)證型中，脾虛濕熱組中纖毛菌屬（Leptotrichia）、彎曲桿菌屬（Camphlobacter）、奇異菌屬（Atopobium）、顆粒鏈菌屬（Granulicatella）以及鏈球菌屬（Streptococcus）的豐度較高，其預(yù)后較差；而濕熱內(nèi)蘊(yùn)組中的豐度最低（除彎曲桿菌屬外），其預(yù)后較好。

本文研究顯示，胰腺癌不同中醫(yī)證型的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異及其預(yù)后具有一定的相關(guān)性。然而，腸道微生態(tài)是一個十分復(fù)雜的系統(tǒng)，飲食習(xí)慣、藥物治療、大便頻率和規(guī)律等因素都是影響微生物群組成的因素，應(yīng)予以考慮。所產(chǎn)生的改變也需要系統(tǒng)的、復(fù)雜的評價方法。此外，本研究存在樣本量過小、分組不均衡、截尾樣本率偏高等問題，后續(xù)研究需要進(jìn)一步完善。