生物技術(shù)處理船舶艙底含油污水

石建強，張少君，王明雨

(山東交通學(xué)院船舶與輪機工程學(xué)院，山東威海 264200)

0 引言

船舶在運行過程中產(chǎn)生含油污水，如果未加處理就排放，污水進入水體或土壤會影響生態(tài)環(huán)境和人類健康，且難以在短時間內(nèi)清除。隨著航運業(yè)的快速發(fā)展，如何治理船舶艙底的含油污水(以下簡稱含油污水)越發(fā)受到人們的重視[1-2]。含油污水主要由船舶機艙內(nèi)各系統(tǒng)中的油泄漏產(chǎn)生，含有大量乳化油及石油烴類污染物，主要采用物理法、化學(xué)法和生物法[3]處理，相較于物理法和化學(xué)法，生物法具有安全可靠、成本低、處理效果好、無二次污染等特點[4]。

石油烴污染物最終是由海洋微生物自然降解而消除，微生物修復(fù)技術(shù)是處理石油烴污染物最有效的方法[5-6]。據(jù)報道，已經(jīng)篩選分離出來的石油烴降解菌有100余屬，200多種[7]。林佳輝等[8]從青海油田附近被石油污染的土壤中分離得到一株中度嗜鹽菌SalinicolazeshuniistrainN4T，對柴油的5 d降解率為56%。AI-Hawash等[9]從魯邁拉油田分離得到2株原油降解真菌RMA1和RMA2，14 d后對原油的降解率分別為57%和55%。船舶艙底含油污水的成分復(fù)雜，單一菌株大多只能降解一種或是幾種烴類，含油污水的復(fù)雜性決定了需要多種菌株共同參與降解[10]。羅群等[11]從含油污水中篩選菌株構(gòu)建復(fù)合菌群，菌群對含油污水的降解率達到73.11%，比單菌株提高了30%。Chaudhary等[12]利用兩株石油降解菌K-6、Y2-2和一株固氮菌KCTC 2426構(gòu)建復(fù)合菌群，處理40 d后，從土壤中清除83.10%的柴油。相較于單一菌株，復(fù)合菌群可極大提高對石油污染物的降解率[13-15]，構(gòu)建復(fù)合降解菌群將成為油污處理最經(jīng)濟環(huán)保的手段。

本研究對含油污水分離純化得到S1、S2和S5三株高效石油烴降解菌，構(gòu)建復(fù)合菌群S15并考察不同環(huán)境因素下菌群對烴降解能力的影響，研究菌群對烴類物質(zhì)降解的特性，以期為生物技術(shù)清除含油污水提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 試驗材料與方法

1.1 試劑

生物試劑盒購自某生物科技有限公司；引物、測序委托某生物科技有限公司合成。0#柴油購于某中國石化加油站；二氯甲烷、正己烷、石油醚、丙酮等均為色譜純。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

從含油污水中分離出23株石油烴降解菌，優(yōu)選對含油污水耐受性最好、降解率最高的5株石油烴降解菌S1、S2、S3、S4和S5，進行復(fù)配菌群構(gòu)建。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母膏、NaCl的質(zhì)量濃度分別為10、5、2 g·L-1。

無機鹽培養(yǎng)基：C10H14N2Na2O8、KH2PO4、CaCl2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl的質(zhì)量濃度分別為0.01、3.0、0.01、1.5、0.1、2 g·L-1,pH值為7.5±0.1。

柴油培養(yǎng)基：量取4 g·L-1的滅菌柴油添加到無機鹽培養(yǎng)基中。

富集培養(yǎng)基：量取4 g·L-1的滅菌艙底含油污水添加到無機鹽培養(yǎng)基中。

1.3 試驗方法

1.3.1 篩選高效降解菌

將加入5 mL含油污水的無機鹽培養(yǎng)基放在37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的恒溫搖床上富集培養(yǎng)48 h，每次取3 mL發(fā)酵后的培養(yǎng)液連續(xù)轉(zhuǎn)接3代，將傳代完成后的新鮮培養(yǎng)液再按照10-1～10-7梯度稀釋，分別涂布到LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基平板；將培養(yǎng)基平板置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)2 d，分離純化平板上的菌落并編號整理，轉(zhuǎn)接至富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并觀察菌落的生長狀況。

1.3.2 單株菌對柴油的降解率

1)柴油的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

用石油醚萃取柴油培養(yǎng)基并稀釋至適宜質(zhì)量濃度，用紫外分光光度計進行全波長掃描，確定最佳吸收波長。配制質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20、30、40 mg·L-1的柴油標(biāo)樣系列溶液，在最佳波長下讀取吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)柴油降解率

將5株菌株以2%的體積分數(shù)分別接種到柴油培養(yǎng)基，在37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的恒溫搖床上培養(yǎng)7 d。以未接入菌株的空白柴油培養(yǎng)基為對照組，每組試驗設(shè)置3個平行組。取發(fā)酵液在離心溫度為4 ℃，9000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心轉(zhuǎn)動15 min；取20 mL石油醚對離心后上清液萃取，超聲波振蕩10 min后靜置分層，回收上層有機相，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，倒入50 mL容量瓶中，定容后保存待測。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中柴油的降解率[16]

(1)

式中：C1為對照組中的柴油的質(zhì)量濃度，C2為樣品中的柴油的質(zhì)量濃度。

1.3.3 復(fù)合菌群的構(gòu)建

將篩選出的優(yōu)勢菌株按照不同的配伍，等比例接種構(gòu)建復(fù)合菌群。將不同的菌群分別接種到柴油培養(yǎng)基，以未接入菌株的空白柴油培養(yǎng)基為對照組，每組試驗設(shè)置3個平行組，在37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的恒溫搖床上培養(yǎng)7 d，然后計算各菌群的降解率并進行對比，篩選出最佳降解菌群。

1.3.4 菌株16S rDNA鑒定

表1 PCR反應(yīng)程序

溫度/℃時間/s循環(huán)次數(shù)94180194 30 58 303572 60726001

將篩選出的優(yōu)勢株菌進行16S rDNA鑒定。使用生物試劑盒提取菌株基因組序列，利用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-AAGGAGGTGWTCCARCC-3′)對菌株16S rDNA基因進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增。PCR擴增反應(yīng)程序設(shè)計見表1，委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成測序。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用局部序列排比檢索工具(basic local alignment search tool，BLAST)方法對測序結(jié)果進行序列比對，選取同源性較高的序列。采用CLUSAL X軟件比對序列，使用MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining(N-J)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.3.5 環(huán)境因素對菌群降解率的影響

1)鹽度

將光密度D(λ)600 nm=1.5的菌液按2%的接種體積分數(shù)接入6組NaCl質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8、10 g·L-1的柴油培養(yǎng)基中。在37 ℃恒溫、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)7 d，每組實驗設(shè)置3個平行組，檢測每組菌液的殘油質(zhì)量濃度，分別計算降解率并進行對比，選擇最適鹽度。

2)pH

將D(λ)600 nm=1.5的菌液按2%的接種體積分數(shù)，在最適鹽度下接入pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的5組柴油培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫、轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)7 d，每組實驗設(shè)置3個平行組，測定每組菌液的殘油質(zhì)量濃度，分別計算降解率并進行對比，選擇最佳pH值。

3)溫度

將D(λ)600nm=1.5的菌液按2%的接種體積分數(shù)，在最適鹽度和pH值下接入5組柴油培養(yǎng)基中，將5組菌液分別置于溫度為25、30、35、40、45 ℃的環(huán)境下，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時振蕩培養(yǎng)7 d，每組實驗設(shè)置3個平行組，測定每組菌液7 d后的殘油質(zhì)量濃度，分別計算降解率并進行對比，選擇最佳溫度。

1.3.6 菌群產(chǎn)表面活性劑

1)表面張力

在室溫下，使用表面/界面張力儀測量方法中的鉑金環(huán)法測定單株菌及菌群發(fā)酵液在0～10 d內(nèi)的表面張力，重復(fù)3次取平均值。

2)乳化活性

采用乳化指數(shù)(E24)法，按照1:1的比例，分別將菌株活化培養(yǎng)后的發(fā)酵液、上清液、等體積菌體重懸液與4種烷烴物質(zhì)加入10 mL試管中，漩渦震蕩3 min，室溫靜置24 h后計算E24[18]，重復(fù)3次取平均值。

(2)

式中：Hr為乳化層高度,Hy為有機相總高度。

3)細胞疏水性

將培養(yǎng)5 d后的菌株發(fā)酵液在10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min，采用生理鹽水洗滌收集的菌體并稀釋至D(λ)600nm=0.5。取4 mL菌體重懸液加入等體積的4種烷烴物質(zhì)，以不加入菌體重懸液的烷烴物質(zhì)為對照組，漩渦震蕩2 min，靜置30 min后取下層水相測量D(λ)，重復(fù)3次取平均值。細胞疏水性(cell surface hydrophobicity，CSH)為[19]

(3)

式中：D(λ)S為試驗組光密度，D(λ)D為對照組光密度。

4)表面活性劑

參考Biniarz的方法[20]提取表面活性劑，使用高效液相色譜(島津LC-20AT)檢測粗提物，將乙腈-水-TFA溶液分別作為流動相A和流動相B，洗脫速度為1.0 mL·min-1，色譜柱溫度為35 ℃，進樣量為10 μL，設(shè)二極管陣列(photo diode array，PDA)檢測器檢測波長為210、254、280、320、450 nm，通過內(nèi)部添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法判斷表面活性劑的性質(zhì)。

1.3.7 菌群降解柴油的GC-FID測定

將菌群按2%的接種體積分數(shù)接種到柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基中(柴油的質(zhì)量濃度為4 g·L-1)，在最適生長環(huán)境下培養(yǎng)7 d，采用GC-FID(島津GC-2014C)測定菌株發(fā)酵液。GC-FID載氣為高純N2，色譜柱選用Wonda Cap 5(規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱溫50 ℃，保留1 min，然后以5 ℃·min-1的速度將柱溫增加至280 ℃，進樣口和檢測器溫度均為280 ℃，采集60 min，得到氣相色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單株菌

2.1.1 篩選

分離純化后得到5株形態(tài)完整、生長良好的高效原油降解菌S1、S2、S3、S4和S5，如圖1所示，5株菌在LB培養(yǎng)基上的顯微形態(tài)觀察結(jié)果如表2所示。

圖1 S1～S5在平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

表2 S1～S5菌落的顯微形態(tài)

2.1.2 柴油的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

全波長范圍掃描溶有石油烴的石油醚樣品，在波長為256 nm時有明顯的吸收峰，測試波長為256 nm。以樣品質(zhì)量濃度為x軸，對應(yīng)吸光度為y軸，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為：y=0.002 0x+0.001，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 38，擬合度較高，適用于分析測試油污的質(zhì)量濃度。

2.1.3 降解率

采用紫外分光光度計，通過柴油標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程計算5株菌在柴油培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d后培養(yǎng)基中殘油的含量，得到菌株S1～S5對柴油的7 d降解率分別為68.05%、62.72%、11.25%、20.11%和42.47%。

2.2 復(fù)合菌群

將篩選出的優(yōu)勢菌株S1、S2和S5按照不同的配比構(gòu)建4組復(fù)合菌群，分別命名為S12、S15、S25、和S125，測試復(fù)合菌群及不含菌群的空白組對柴油的7 d降解率，結(jié)果分別為75.17%、83.12%、53.77%、77.87%和0，因此，S15為最佳降解復(fù)合菌群。S15由S1、S52株菌組合而成，降解率高于單株菌及其它菌群，推測這2株菌之間存在協(xié)同降解作用，有利于石油烴的降解消除。通過菌落形態(tài)觀察，菌株S1和S5可能為芽孢桿菌屬，有研究表明芽胞桿菌屬內(nèi)親緣性近的菌株復(fù)配主要表現(xiàn)為協(xié)同降解作用[21]，需進一步做分子鑒定來確定菌屬。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗2株石油烴降解菌S1和S5的16S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物，得到相應(yīng)的電泳圖譜，如圖2所示。檢測結(jié)果表明所提取DNA純度較好，符合測序要求。

圖2 S1、S5的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜

使用N-J法在MEGA 7.0軟件中進行建樹分析，如圖3所示。鑒定結(jié)果表明S1菌株為Bacillustoyonensis，S5菌株為Bacillusalbus，均為芽孢桿菌屬。關(guān)于芽孢桿桿菌強化降解石油污染的文獻很多，Parthipan等[22]研究發(fā)現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌可產(chǎn)天然脂肽類表面活性劑，對石油的降解率為87%。由此推測S15具有高降解率的原因是其內(nèi)部的各單菌均為可分泌天然脂肽的芽孢桿菌，脂肽在石油烴的降解過程中起到乳化、增溶的作用，且彼此之間表現(xiàn)為協(xié)同降解，因此S15對石油污染環(huán)境具有修復(fù)潛力和應(yīng)用前景。

圖3 S1、S5的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

2.4 不同環(huán)境因素下S15的降解率

在不同鹽度、pH值及溫度下培養(yǎng)S157 d后測定S15對柴油的降解率，鹽度不同時的測定結(jié)果如圖4所示。NaCl的質(zhì)量濃度為0時，S15對柴油的降解效率為82.58%；在NaCl質(zhì)量濃度為0～2 g·L-1時，S15仍保持較高的降解效率；S15對柴油的降解效率隨著鹽度的升高而迅速降低，尤其是NaCl的質(zhì)量濃度大于6 g·L-1時，降解率急劇下降，說明S15在低鹽環(huán)境中可發(fā)揮最佳的降解效果。

S15對pH值變化的耐受性較寬泛，如圖5所示。當(dāng)pH值為7.5時，S15的降解率高達81.95%，pH值為6～8時S15保持較好的降解效果，S15的降解率隨堿性的增強顯著下降。含油污水的環(huán)境一般為中性，測試結(jié)果表明S15適用于處理含油污水。

圖4 S15降解效率隨鹽度的變化規(guī)律 圖5 S15降解效率隨pH的變化規(guī)律

圖6 S15降解率隨溫度的變化規(guī)律

S15對柴油的降解率隨溫度的變化規(guī)律如圖6所示，可以看出，S15在25～35 ℃時對柴油的降解能力較高，35 ℃時S15的降解率最佳，為81.96%。此后，S15的降解率隨溫度的升高呈線性下降。含油污水的溫度一般為25～35 ℃，所以S15適用于處理含油污水。

2.5 菌群產(chǎn)表面活性劑特性

2.5.1 表面張力

圖7 不同菌株發(fā)酵液的σ

測定S1、S5及S15活化后在發(fā)酵液0～10 d的表面張力σ，結(jié)果如圖7所示。S1發(fā)酵液的σ在2 d后趨于平穩(wěn)，σ=(38±2)mN·m-1；6 d后σ升高，菌株產(chǎn)表面活性劑能力降低；S5發(fā)酵液的σ在5 d時達到最低，為38.42 mN·m-1，之后σ隨時間延長逐漸回升。S1與S5發(fā)酵液的σ回升可能是培養(yǎng)基pH的改變限制了菌株繼續(xù)產(chǎn)生表面活性劑，也有可能是部分生物表面活性劑被菌株當(dāng)作碳源消耗[23]；S15發(fā)酵液的σ隨時間延長持續(xù)降低，在7 d時達到最低，為27.60 mN·m-1，之后σ開始升高，10 d后σ為30.21 mN·m-1，菌群降低σ的能力較好。一般認為，能將σ降低到45 mN·m-1以下的菌株可視為產(chǎn)表面活性劑菌[24]。根據(jù)試驗結(jié)果可判斷S1、S5以及S15均能產(chǎn)表面活性劑，能使菌株與疏水烴類物質(zhì)成分充分接觸，因此S15對柴油具有良好的降解效果。

2.5.2 乳化特性與細胞疏水性

測定靜置24 h后的S1、S5及S15的發(fā)酵液、上清液、菌懸液與不同烷烴類物質(zhì)的乳化指數(shù)E24，如圖8、9所示。由圖8、9可以看出，S1與S5對十六烷、正辛烷、正己烷和二甲苯的乳化特性形成互補，S1對十六烷和正辛烷有較高的乳化能力，S5對正己烷和二甲苯有較高的乳化能力。

圖8 S1對不同疏水底物的E24 圖9 S5對不同疏水底物的E24

測定S15對不同疏水底物的E24，如圖10所示。由圖10可以看出，S15對4種疏水底物的E24均超過80%，乳化效果較好，大大增加了降解菌群與烴類的接觸面積，可與烴類形成穩(wěn)定的乳狀液體，促進降解菌群對烴類的攝取和降解。

細胞疏水性(cell surface hydrophobicity，CSH)是決定細胞表面黏附性的主要因素[25]。一般細胞疏水性CSH越高，菌株對該類烷烴的吸附效果越好。不同菌株對不同疏水底物的CSH測定結(jié)果如圖11所示，相較于S1、S5，S15對4種烴類疏水底物的CSH均大于50%，表現(xiàn)出較好的細胞疏水性。結(jié)合圖7可以推測，S1產(chǎn)表面活性劑的能力低于S5，S1對烴類的疏水能力差，S15具有持續(xù)產(chǎn)生生物表面活性劑的能力，大大提高了其細胞表面疏水能力，對烷烴類物質(zhì)普遍具有較好的吸附特性，這也是S15具有較高降解率的原因。顯然，生物表面活性劑產(chǎn)量的變化在一定程度上影響菌株的乳化性和疏水性，試驗結(jié)果與許學(xué)峰等[26]得到的結(jié)論一致。菌株分泌天然表面活性劑使得S15乳化烷烴類物質(zhì)效果更好，有利于進一步利用并降解石油烴。

圖10 S15對不同疏水底物的E24 圖11 不同菌株對不同疏水底物的CSH

2.5.3表面活性劑

圖12 S15發(fā)酵液粗提物的HPLC測試結(jié)果

對S15發(fā)酵液的粗提物與標(biāo)準(zhǔn)品分別進行高效液相色譜(high performance liquid chromatograph,HPLC)檢測，流動相A (乙腈、水、TFA的體積比為10:89.2:0.8)和流動相B(乙腈、水、TFA的體積比為89.2:10:0.8)梯度洗脫0～20 min，一次洗脫所用流動相B的體積比為5%～15%，流速為1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，PDA檢測波長為254 nm，測試結(jié)果如圖12所示。在保留時間t分別為7.178、7.882、9.600、10.506、10.741、15.552 min時，分別出現(xiàn)6個脂肽吸收峰。可初步判斷，菌群分泌的表面活性劑類型為脂肽型表面活性劑，是微生物生長繁殖過程中產(chǎn)生的重要次級代謝產(chǎn)物[27]，可分離得到多種能夠分泌生物表面活性劑的芽孢桿菌[28-29]。生物表面活性劑具有良好的乳化增溶性能，能顯著提高石油烴降解菌對污染物的生物利用度[30]。

2.5.4降解分析

在以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d(柴油的質(zhì)量濃度為4 g·L-1)，分析S15對柴油烷烴C10～C28的降解率。S15對柴油各組分降解GC-FID效果如圖13所示，測試數(shù)據(jù)如表3所示。

a) 降解前 b) 降解后圖13 GC-FID檢測柴油圖譜

表3 S15對柴油各組分的降解率

柴油主要由碳原子數(shù)為C10～C22的復(fù)雜烴類混合物構(gòu)成，由圖13、表3可看出，菌群S15對柴油組分中短鏈烴類的降解效果高于中鏈烷鏈和長鏈烷烴，原因是S15對長鏈烷烴的乳化和攝取能力隨碳鏈的增加而變差。與單菌株S1和S5相比，菌群S15對柴油的降解效果具有更加明顯的優(yōu)勢。試驗結(jié)果表明，混合菌群是生物法處理石油烴污染物的有效工具。

3 結(jié)論

1)分離自船舶艙底含油污水中的菌株S1和S5均具有高效的柴油降解能力，經(jīng)16S rDNA鑒定S1為Bacillustoyonensis、S5為Bacillusalbus，S1與S5屬于可分泌表面活性劑的芽孢桿菌，芽胞桿菌屬內(nèi)親緣性近的菌株，復(fù)配表現(xiàn)為協(xié)同降解作用。

2)構(gòu)建復(fù)合菌群并選擇降解表現(xiàn)最佳菌群S15。 S15在表面活性劑的作用下，表現(xiàn)出極高的乳化能力(80%以上)和CSH(50%以上)，經(jīng)HPLC分析顯示，該表面活性劑為脂肽類生物表面活性劑，在降解過程中起到乳化增溶石油烴污染物的作用，促進S15對石油的攝取和降解。S15的7 d平均柴油降解率達83.12%，其中對短鏈烷烴的降解率高達97.84%，高于單株菌以及其它菌群對柴油的降解率。S15對石油污染環(huán)境具有較強的修復(fù)潛力和應(yīng)用前景。