轉基因抗蟲玉米CM8101對根際土壤主要理化性質和功能酶活性的影響

梁晉剛，欒穎，宋新元，張正光*

(1.南京農業(yè)大學 植物保護學院，江蘇 南京 210095； 2.農業(yè)農村部科技發(fā)展中心，北京 100176; 3.吉林省農業(yè)科學院 農業(yè)生物技術研究所，吉林 長春 130033)

自從1996年轉基因作物開始商業(yè)化種植以來，抗蟲、抗病、抗逆境、耐除草劑和品質改良等轉基因作物相繼問世，有效地緩解了人口膨脹、資源短缺、天氣惡劣等影響糧食產量的問題，也使全球的農民從中收獲巨大的經濟收益，但轉基因作物的安全問題一直被人們密切關注，尤其是轉基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)存在的潛在影響[1-3]。

轉基因作物可通過其凋落物殘體或根際分泌物等影響土壤理化性質(如土壤含水量、pH值)、微生物群落結構及功能酶活性(如脲酶、磷酸酶)，從而在一定程度上對土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生物化學反應進程產生影響[1,4-5]。因此，研究轉基因作物的種植對土壤主要理化性質和功能酶活性的影響對于完善轉基因作物環(huán)境安全評價體系具有重要意義[2]。

培育新型抗蟲轉基因玉米，對于延緩害蟲抗性、提高玉米產量、增加農民收入具有重要意義。利用植物的偏好密碼子，重新設計和改造Cry1Ab基因并獲得新型抗蟲基因Cry1Ab-Ma，采用農桿菌介導法將Cry1Ab-Ma基因轉入玉米鄭58中，獲得的轉基因玉米CM8101具有較好的抗蟲性[6-7]。已有研究表明，轉基因玉米CM8101對白符跳的存活率，赤子愛勝蚓的存活率、體重變化量、蚓繭量和孵化幼蚓量均無顯著影響[8]。本文對轉基因抗蟲玉米CM8101根際土壤主要理化性質和功能酶活性進行了2年的監(jiān)測，以期為轉基因抗蟲玉米CM8101的環(huán)境安全性提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為轉Cry1Ab-Ma基因抗蟲玉米CM8101(CM)和非轉基因對照玉米鄭58(CMCK)，2種試驗材料均由研發(fā)單位中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供。

1.2 試驗設計及土壤采集

試驗時間為2017—2018年，試驗地點位于吉林省農業(yè)科學院轉基因植物環(huán)境安全研究試驗圃。采用隨機區(qū)組設計，每個品種設置3次重復。試驗期間采用當地普通農事管理操作。

2年的土壤樣品都在苗期(SS)、花期(FS)和成熟期(MS)3個生育期采集，3次采樣時間均為每年的6月10日、7月15日、10月10日左右。采用五點取樣法，每個小區(qū)隨機選取5個點(不同生育期的取樣點保持一致)，去除表層土后將作物根部上的土抖落作為根際土均勻地混在一起，然后用四分法取土，過2 mm篩子后放自封袋于-20 ℃保存以待后續(xù)研究[2]。

1.3 土壤主要理化性質的測定

1.3.1 土壤含水量的測定

土壤含水量使用烘干稱重法測定[9]。將采集的新鮮土樣放在105 ℃的烘箱里烘干至恒重，再用公式計算含水量：含水量=(濕土質量-干土質量)/干土質量×100%。

1.3.2 土壤pH的測定

土壤的pH利用電極法來測定[10]。先稱取10 g風干土樣和25 mL蒸餾水于100 mL三角瓶中，充分搖勻后靜置30 min后，再用pH計測定土壤懸液的酸堿度。

1.4 土壤主要功能酶活性的測定

1.4.1 土壤脲酶活性的測定

利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素后產生的NH3-N，來測定土壤脲酶的活性。土壤脲酶活性的測定采用Solarbio公司的土壤脲酶活性測定試劑盒(貨號：BC0125)?；钚詥挝坏亩x：每天每克土壤中產生1 μg NH3-N定義為1個酶活單位。

1.4.2 土壤酸性磷酸酶活性的測定

利用可見分光光度法，通過酸性磷酸酶催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，測定酚的生成量可以計算出土壤酸性磷酸酶的活性。土壤酸性磷酸酶活性的測定采用Solarbio公司的土壤酸性磷酸酶活性測定試劑盒(貨號：BC0140)?；钚詥挝坏亩x：37 ℃中每克土壤每天釋放1 nmol酚為1個酶活單位。

1.5 數據分析

所有數據通過SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，多處理間差異采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan氏多重比較。另外，在不同生育期、不同品種間、不同種植年份間，選擇單因素方差分析對土壤主要理化性質和功能酶活性進行差異顯著性分析[1]。

2 結果與分析

2.1 土壤主要理化性質的變化

如圖1所示，2017年和2018年轉基因玉米CM8101(CM)根際土壤在3個生育期的含水量與非轉基因玉米鄭58(CMCK)對比，沒有顯著性差異；如圖2所示，2017年和2018年轉基因玉米CM8101根際土壤在3個生育期的pH值與非轉基因玉米鄭58對比，沒有顯著性差異。

A—2017年；B—2018年。同生育期柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同。圖1 轉基因玉米CM8101和鄭58根際土壤含水量

通過ANVOA分析可以看出(表1)，2年中不同的玉米品種對含水量和pH均無顯著性影響；不同的生育期和年份會顯著性地影響到含水量和pH值，其中，含水量在不同年份間的F值為29.782、P值為0.000，pH值在不同年份間的F值為9.958、P值為0.003。但在2017年，pH值在各生育期間無顯著性差異。進一步說明轉基因抗蟲玉米CM8101的種植對根際土壤的含水量和pH值均無顯著性影響，并且發(fā)現不同種植年限和作物生育期是影響根際土壤主要理化性質的主要因素。

2.2 土壤主要功能酶活性的變化

如圖3所示，2017年和2018年轉基因玉米CM8101(CM)根際土壤在3個生育期的脲酶活性與非轉基因玉米鄭58(CMCK)對比，沒有顯著性差異；如圖4所示，2017年和2018年轉基因玉米CM8101根際土壤在3個生育期的酸性磷酸酶活性與非轉基因玉米鄭58對比也都沒有顯著性差異。

圖2 轉基因玉米CM8101和鄭58根際土壤pH值

表1 含水量、pH值與年份、生育期和品種的ANOVA比較分析

注：*表示達顯著水平(P<0.01)。表2同。

通過ANVOA分析可以看出(表2)，2年中不同的玉米品種對脲酶和酸性磷酸酶活性均無顯著性影響；不同的年份會顯著性地影響脲酶和酸性磷酸酶活性，其中，脲酶在不同年份間的F值為137.631、P值為0.000，酸性磷酸酶在不同年份間的F值為39.294、P值為0.000。進一步說明轉基因抗蟲玉米CM8101的種植對脲酶和酸性磷酸酶活性均無顯著性影響，并且發(fā)現不同種植年份是影響根際土壤主要功能酶活性的主要因素。

圖3 轉基因玉米CM8101和鄭58根際土壤脲酶活性

圖4 轉基因玉米CM8101和鄭58根際土壤磷酸酶活性

表2 酶活性與年份、生育期和品種的ANOVA比較分析

3 討論

轉基因作物的種植對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響尚無定論，而土壤又是植物、土壤動物、土壤微生物等物質交換和能量流動的重要場所。本文以轉Cry1Ab-Ma基因抗蟲玉米CM8101和對照非轉基因玉米鄭58為試驗材料，進行了為期2年的田間試驗，采集根際土壤樣品后測定了3個生育期的主要理化性質(含水量和pH值)和功能酶活性(脲酶和酸性磷酸酶)，結果表明，轉基因抗蟲玉米CM8101的種植不會對土壤主要理化性質和功能酶活性產生顯著性影響，且在已知范圍內發(fā)現不同生育期和種植年份是影響土壤主要理化性質和功能酶活性的主要因素。本文研究結果為轉基因抗蟲玉米CM8101的環(huán)境安全性提供了可靠數據支持。

3.1 轉基因抗蟲玉米CM8101種植對土壤主要理化性質的影響

土壤理化性質是評價土壤質量的關鍵指標[11]，然而在種植轉基因作物后，其根系分泌物或其外源物質在土壤中殘留，都可能會改變土壤理化性質。已有的研究表明，轉基因抗蟲水稻華恢1號的種植對土壤pH值無顯著性影響[12]；轉Bt基因水稻(克螟稻)根系分泌物中有機酸(主要為酒石酸)的含量顯著降低，導致作物根系土壤pH值顯著性升高[13]；轉入木質素過氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿會產生非預期效應，降低枝葉重量、提高氮和磷的含量，進而其種植會導致土壤pH值升高[14]；我們此前的研究發(fā)現，轉基因高蛋氨酸大豆ZD91和轉基因抗蟲玉米IE09S034的種植對土壤含水量和pH值均無顯著性影響[1-2]。因此，轉基因作物的種植對土壤主要理化性質的影響，應當采取個案分析的原則，具體問題具體分析。

3.2 轉基因抗蟲玉米CM8101種植對土壤主要功能酶活性的影響

已有的研究表明，轉基因抗蟲耐草甘膦大豆ZB對土壤堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性無顯著影響[15]；轉Bt基因水稻種植后會導致土壤脲酶活性發(fā)生顯著性變化，變化幅度受土壤類型和生育期的影響[16]；轉Bt基因玉米種植前期會顯著性提高脲酶的活性，后期與非轉基因玉米的脲酶活性相比沒有顯著性差異，對磷酸酶活性一直沒有顯著性差異[17]；轉入木質素過氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿會產生非預期效應，降低枝葉重量、提高氮和磷的含量，進而其種植會導致磷酸酶的活性降低[14]；轉Bt基因水稻的殘體對土壤磷酸酶活性沒有顯著性影響[18]；我們此前的研究發(fā)現，轉基因高蛋氨酸大豆ZD91和轉基因抗蟲玉米IE09S034的種植對土壤蔗糖酶、堿性磷酸酶、脲酶活性均無顯著性影響[1-2]。土壤中包含了多種多樣的酶，研究時有必要選取具有代表性的酶進行分析。