三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化研究

孫菊鮮，康春婷，遠(yuǎn)宜彤，李釗，葛欣，辛琪

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

類胡蘿卜素是具有重要應(yīng)用價(jià)值的萜類脂溶性化合物，主要包括番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素等，是自然界中重要的天然色素，在細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體免疫和抗氧化等方面都有重要的作用[1-2]。隨著類胡蘿卜素的藥用價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量和種類的需求越來越大，但是包括人在內(nèi)的很多動(dòng)物不能自身合成，只能依靠外界食物獲取，而食物中類胡蘿卜素含量參差不齊且提取過程復(fù)雜，難以滿足人們的需求。因此，利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株成為必然需求，而此技術(shù)體系中宿主菌的選擇至關(guān)重要。釀酒酵母因生長(zhǎng)繁殖速度快，遺傳操作簡(jiǎn)單，安全可靠，存在高效合成萜類的甲羥戊酸途徑[3]，成為理想的真核表達(dá)宿主菌，故選擇釀酒酵母作為底盤菌株，更有利于我們對(duì)類胡蘿卜素合成代謝的研究。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素已成為最有前景的生產(chǎn)方法。其中，三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、單位菌體β-胡蘿卜素產(chǎn)量高等明顯優(yōu)勢(shì)，是目前生產(chǎn)β-胡蘿卜素的理想菌株，在歐洲早已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[4]，其類胡蘿卜素的合成代謝途徑已被闡明[5]。在三孢布拉氏霉菌類胡蘿卜素代謝過程中八氫番茄紅素合成酶(CarRA)可催化其中間產(chǎn)物二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP)形成八氫番茄紅素，然后經(jīng)過八氫番茄紅素脫氫酶(CarB)作用形成番茄紅素，最后通過番茄紅素環(huán)化酶(CarRA)生成β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素繼續(xù)氧化成其他類型的類胡蘿卜素。其中CarB和CarRA是類胡蘿卜素合成代謝過程中的關(guān)鍵酶。CarRA為雙功能蛋白，具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：(i)位于5＇端附近的R-domain，其具有番茄紅素環(huán)化酶活性和(ii)位于R結(jié)構(gòu)域下游的A(或P)結(jié)構(gòu)域，具有八氫番茄紅素合成酶活性[6-8]。在三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究中，為了高產(chǎn)所需要的類胡蘿卜素，目前主要是通過添加代謝抑制劑和促進(jìn)劑的方式，比如通過添加番茄紅素環(huán)化酶的抑制劑，可以促進(jìn)菌株積累番茄紅素，而我們目前的策略是通過定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化改變R-domain的番茄紅素環(huán)化酶活性，從而影響代謝過程中番茄紅素的環(huán)化，最終影響番茄紅素和β-胡蘿卜素的合成。

定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化是通過酶工程改變酶活性的兩種重要的方法。定點(diǎn)突變是建立在對(duì)酶結(jié)構(gòu)背景清晰的基礎(chǔ)上完成的理性突變，進(jìn)而改變酶的催化特性；而定向進(jìn)化是不需要獲知酶的空間結(jié)構(gòu)，通過“盲目的”隨機(jī)突變構(gòu)建酶基因的突變體文庫，進(jìn)而利用特定的高效篩選方法獲得性狀改變的突變酶，是一項(xiàng)體外改造酶的較為成熟的技術(shù)，已被成功用于改造酶的活性、熱穩(wěn)定性和底物專一性等[9-10]。定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化相輔相成，在酶突變的研究中可以互相補(bǔ)充，相得益彰。因此，為進(jìn)一步探究三孢布拉氏霉菌類胡蘿卜素合成代謝過程中番茄紅素環(huán)化酶對(duì)類胡蘿卜素合成的影響，本文通過在釀酒酵母中重構(gòu)類胡蘿卜素代謝途徑，在此基礎(chǔ)上對(duì)番茄紅素環(huán)化酶CarRA蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，采用定點(diǎn)突變和建立依賴于酵母同源重組的隨機(jī)突變體庫的方法研究番茄紅素環(huán)化酶酶活性的高低，篩選出影響該蛋白活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為番茄紅素環(huán)化酶活性位點(diǎn)的研究奠定理論基礎(chǔ)，以便應(yīng)用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α菌株、釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW303菌株、釀酒酵母工程菌株W303-thmgr-bts1、W303-thmgr-tbs1-carB(W303-B)、質(zhì)粒pYES2均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。所使用主要引物的序列信息列表1。

表1 主要引物的序列信息

1.1.2 主要試劑

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)、乙酸乙酯購自天津科密歐公司；番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、γ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、IPTG購自Sigma公司；DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、dNTPs購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自Biomiga公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、酵母粉5 g·L-1。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L-1、酵母浸出物 10 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1。

SC-半乳糖培養(yǎng)基：YNB 6.7 g·L-1、半乳糖20 g·L-1、缺省氨基酸母液和特定氨基酸。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam(http://web.expay.org/protparam)對(duì)CaRA蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，用Protscale(http://web.expasy.org/protscale.html)對(duì)蛋白質(zhì)的親疏性進(jìn)行分析。采用TMHMM Server V2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)。利用predictprotein(http://WWW.predictprotein.org/)對(duì)該蛋白進(jìn)行突變位點(diǎn)掃描分析。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以番茄紅素環(huán)化酶的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到的R結(jié)構(gòu)域的基因片段，與線性化的表達(dá)載體連接構(gòu)建R表達(dá)載體，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 點(diǎn)突變表達(dá)載體的構(gòu)建

以pYES2-CarRA載體為模板，設(shè)計(jì)重疊PCR 引物，在引物的末端分別引入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)與載體有同源臂的引物：F1、R1，內(nèi)部的同源臂引物：F2、R2，以F1、R2和F2、R1為引物，分別擴(kuò)增獲得兩個(gè)片段。突變點(diǎn)構(gòu)建在重疊區(qū)域，存在于兩個(gè)擴(kuò)增片段中。再通過同源重組使兩個(gè)片段連接起來，即可得到目標(biāo)突變片段。

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化

采取PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞涂布于相應(yīng)的SC培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子克隆數(shù)并算出轉(zhuǎn)化效率。

1.2.5 隨機(jī)突變體庫構(gòu)建

根據(jù)已克隆得到的carRA序列，設(shè)計(jì)易錯(cuò)PCR引物。根據(jù)突變頻率和模板濃度的關(guān)系，確定適宜的易錯(cuò) PCR反應(yīng)體系和條件，用隨機(jī)突變?cè)噭┖袛U(kuò)增得到隨機(jī)突變片段。將目的片段和線性化pYES2載體同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞建立依賴于酵母同源重組的隨機(jī)突變體庫。

1.2.6 酵母中類胡蘿卜素含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)酵母中類胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析番茄紅素環(huán)化酶的氨基酸序列特征

由于三孢布拉氏霉菌的CarRA為雙功能蛋白，其N端部分含有2個(gè)為番茄紅素環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)域(R)，通過折疊形成同型二聚體結(jié)構(gòu)；C端部分為八氫番茄紅素合成酶結(jié)構(gòu)域(A)。對(duì)R結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸保守位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，PLEE和PVEE是其中的高保守性氨基酸位點(diǎn)，推測(cè)這些氨基酸對(duì)R結(jié)構(gòu)域的功能有較大影響(圖1中A)，可作為定點(diǎn)突變的靶點(diǎn)。利用ProtParam分析可知R結(jié)構(gòu)域包括240個(gè)氨基酸，分子量為27703.09 u，等電點(diǎn)為8.39；R結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中α螺旋結(jié)構(gòu)占36.67%，隨機(jī)卷曲序列占35.84%，無β折疊存在。ProtScale分析氨基酸的親水性結(jié)果顯示，CarRA整體為疏水性蛋白，并在178位氨基酸處出現(xiàn)了較高的疏水性(圖1中B)?；赥MHMM法對(duì)該蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)R結(jié)構(gòu)域中有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是該蛋白定位于細(xì)胞膜上的重要指征(圖1中C)。為進(jìn)一步了解番茄紅素環(huán)化酶的空間結(jié)構(gòu)對(duì)活性的影響，試圖對(duì)該酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果并未找到可供使用的模型，也無法通過生物信息學(xué)計(jì)算得到空間結(jié)構(gòu)信息，因此，可以開展該酶的定向進(jìn)化研究。此外利用predictprotein對(duì)R結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變位點(diǎn)掃描分析，從中篩選出一系列對(duì)蛋白功能影響較大的突變位點(diǎn)，可作為定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化的靶點(diǎn)。

2.2 產(chǎn)番茄紅素和β-胡蘿卜素的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建

為研究番茄紅素環(huán)化酶的活性，構(gòu)建了R結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體，考察該蛋白在大腸埃希菌中異源表達(dá)情況，但目的蛋白并未成功表達(dá)，其可能與該蛋白是一個(gè)7次跨膜的膜蛋白有關(guān)。由于難以在大腸埃希菌中表達(dá)，故選擇在釀酒酵母菌株中進(jìn)行功能研究。

根據(jù)三孢布拉氏霉菌中類胡蘿卜素的生物合成途徑，在釀酒酵母中過表達(dá)thmgr和bts1兩個(gè)基因(來源于酵母)，分別編碼HMG-COA還原酶和GGPP合成酶，構(gòu)建了GGPP高產(chǎn)菌株(W303-thmgr-bts1)，并在此基礎(chǔ)上導(dǎo)入三孢布拉氏霉菌的carRA和carB基因，在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了β-胡蘿卜素合成途徑的構(gòu)建，在SC-半乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈現(xiàn)出黃色，表明重組酵母菌成功合成β-胡蘿卜素，菌株命名為W303-thmgr-bts1-carB-carRA(W303-C)。此外，在釀酒酵母GGPP高產(chǎn)底盤菌中同時(shí)表達(dá)菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)的crtB基因(編碼八氫番茄紅素合成酶)和三孢布拉氏霉菌的carB基因，結(jié)果表明，重組菌株成功合成了番茄紅素，菌株顏色為粉紅色，命名為W303-thmgr-bts1-crtB-carB(W303-L)。與出發(fā)菌株比較，二者顏色出現(xiàn)顯著差別，因此，可直接利用平板菌落顏色的變化來表征番茄紅素環(huán)化酶的活性。由于目前沒有簡(jiǎn)便的番茄紅素環(huán)化酶酶活性測(cè)定方法，建立通過構(gòu)建重組菌株比較顏色差異來表征酶活性的方法為定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 定點(diǎn)突變分析三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶的關(guān)鍵氨基酸

為了研究該酶的催化機(jī)制，以上述兩株重組菌株為對(duì)照，W303-thmgr-tbs1-carB(W303-B)菌株為出發(fā)菌株構(gòu)建番茄紅素環(huán)化酶突變體表達(dá)菌株，通過菌株顏色變化和類胡蘿卜素產(chǎn)量測(cè)定，確定影響番茄紅素環(huán)化酶功能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)圖1中A蛋白保守位點(diǎn)分析以及布拉克須霉中的相關(guān)研究結(jié)果[6]，鎖定78位、119位、216位和218位4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，構(gòu)建了CarRA蛋白的5個(gè)點(diǎn)突變體(E78K、E78W、R119D、P216S、P218K)，探究番茄紅素環(huán)化酶的氨基酸序列定點(diǎn)突變后對(duì)蛋白功能的影響。如圖2所示，以E78K突變位點(diǎn)為例，PCR獲得大小依次約為250、1 900 bp的E78Kup、E78Kdown目標(biāo)片段，利用Gibson克隆的方法構(gòu)建5個(gè)表達(dá)載體，將測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株W303-B，獲得5株突變菌株，分別命名為W303-C-E78K、W303-C-E78W、W303-C-R119D、W303-C-P216S、W303-C-P218K。

A—待重組的E78K的突變片段，M—trans2K plus DNA marker，1—E78Kup，2—E78Kdown；B—E78K重組子菌落PCR驗(yàn)證，M—trans2K plus DNA marker，1～3—E78W突變體菌落PCR驗(yàn)證。圖2 E78 K三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶定點(diǎn)突變

為了定量表征突變后番茄紅素環(huán)化酶的酶活力變化，將W303-C、W303-L與突變菌株的顏色表型及HPLC檢測(cè)類胡蘿卜素產(chǎn)量的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，絕大部分樣品經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含有番茄紅素、γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素三種類胡蘿卜素，并且突變菌株中三種類胡蘿卜素產(chǎn)量存在很大差異，與相應(yīng)菌體顏色表型一致(圖3)。與W303-C相比，W303-C-P218K的β-胡蘿卜素和番茄紅素都有少量提高；W303-C-E78W和E78K的番茄紅素產(chǎn)量分別提高了1倍和7倍，并且W303-C-E78K合成的胡蘿卜素種類變少，幾乎沒有γ-胡蘿卜素生成；此外，W303-C-R119D沒有檢測(cè)到類胡蘿卜素產(chǎn)生，菌體呈野生型酵母本色。同時(shí)結(jié)果也表明，不同氨基酸位點(diǎn)的突變對(duì)番茄紅素環(huán)化酶的影響有很大差異，其中E78K位點(diǎn)突變使番茄紅素環(huán)化酶活性大大降低，甚至失活；同一位點(diǎn)突變成不同性質(zhì)的氨基酸，也會(huì)導(dǎo)致酶活性改變；而R119D位點(diǎn)的突變可能造成了番茄紅素環(huán)化酶構(gòu)象的錯(cuò)誤，進(jìn)而影響了八氫番茄紅素合成酶結(jié)構(gòu)域的正確折疊，導(dǎo)致類胡蘿卜素的合成代謝受阻不能生成番茄紅素。

2.4 利用酵母同源重組的方法構(gòu)建隨機(jī)突變體庫

為全面分析和確定三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，開展了該酶的定向進(jìn)化研究。由于CarRA的R結(jié)構(gòu)域和A結(jié)構(gòu)域合在一起，要保證R結(jié)構(gòu)域充分隨機(jī)突變而A部分不變，只能采用兩個(gè)片段分別擴(kuò)增再融合到一起，而在體外要完成這項(xiàng)工作極其復(fù)雜，故試圖在酵母體內(nèi)利用酵母本身的同源重組系統(tǒng)來完成突變體庫的構(gòu)建(圖4)。為成功構(gòu)建隨機(jī)突變體庫，首先以CarRA的D190A突變酶為例，驗(yàn)證酵母同源重組方法的可行性。通過易錯(cuò)PCR得到片段D190A up和D190A down分別為600和1 200 bp，將其和載體pYES2經(jīng)酵母轉(zhuǎn)化后成功構(gòu)建酵母同源重組載體pYES2-D190A(圖5)，測(cè)序結(jié)果表明D190A重組正確。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，SC-半乳糖培養(yǎng)基上菌落數(shù)為194 CFU，轉(zhuǎn)化效率為：1.35×103CFU·μg-1，這表明利用同源重組的方法在酵母轉(zhuǎn)化中是可行的，其轉(zhuǎn)化效率可用來構(gòu)建依賴于酵母同源重組的隨機(jī)突變體庫。

圖3 突變菌株菌體顏色與類胡蘿卜素產(chǎn)量對(duì)比結(jié)果

圖4 體內(nèi)重組法構(gòu)建定向進(jìn)化酶突變體文庫

A—待重組的D190A突變片段，M—trans2K plus DNA marker，1—EcoRⅠ-KpnⅠ雙酶切的質(zhì)粒pYES2，2—D190A down，3—D190A up；B—待重組的隨機(jī)突變片段，M—trans2K plus DNA marker，1—carRA-R隨機(jī)突變片段，2—未突變的carRA-A片段。圖5 體內(nèi)重組構(gòu)建CarRA的D190 A突變酶基因及隨機(jī)突變體基因

在此基礎(chǔ)上，以CarRA(hr)-F和CarRA(random)R為引物經(jīng)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增得到約為780 bp的carRA-R隨機(jī)突變片段(圖5)，利用上述方法將其與未突變的carRA-A序列(約1 200 bp)和線性化載體同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，菌落形成后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，其轉(zhuǎn)化效率為：1.28×103CFU·μg-1，突變體庫總量為1 399 CFU，滿足文庫篩選的要求，隨機(jī)突變體庫構(gòu)建完成。將其影印到SC-半乳糖培養(yǎng)基上，通過挑取克隆子進(jìn)行培養(yǎng)和基因測(cè)序，對(duì)番茄紅素環(huán)化酶突變體的突變位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)分析以及觀察克隆子的菌落顏色，進(jìn)一步篩選和分析對(duì)番茄紅素環(huán)化酶影響較大的突變位點(diǎn)。從表2的結(jié)果中可以看出，通過與對(duì)照菌株(W303-C)相比，不同位點(diǎn)的隨機(jī)突變可對(duì)番茄紅素環(huán)化酶產(chǎn)生不同的影響，進(jìn)而突變菌株呈現(xiàn)不同的菌落顏色。通過對(duì)突變體進(jìn)行篩選得到近15株產(chǎn)β-胡蘿卜素的突變菌株和近50株產(chǎn)番茄紅素的突變菌株。其中3株為高產(chǎn)β-胡蘿卜素的突變菌株，菌株編號(hào)和突變位點(diǎn)分別為4E2(F95L)、4E4(W60R、N227I)和7E1(L177W)，這些位點(diǎn)的突變使番茄紅素環(huán)化酶活性增強(qiáng)而生成大量β-胡蘿卜素，菌落顏色為黃色。另外篩選出6株高產(chǎn)番茄紅素的突變菌株，其編號(hào)和突變位點(diǎn)分別為4D2(I149F)、4G4(F144L、S206G)、4C2(L14P、T228Q)、4C1(H9R、D238H)、4D1(D51G)和4F4(D51G、I194N)，這些突變位點(diǎn)使番茄紅素環(huán)化酶活性降低而積累大量番茄紅素，菌落顏色為紅色。此外，對(duì)于突變體庫中每個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)番茄紅素環(huán)化酶、番茄紅素合成酶酶活及類胡蘿卜素產(chǎn)量的具體影響還需進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。

表2 定向進(jìn)化隨機(jī)突變體庫中部分突變菌株的突變位點(diǎn)及菌落顏色

3 小結(jié)與討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和人們對(duì)類胡蘿卜素應(yīng)用價(jià)值的認(rèn)識(shí)逐步加深，類胡蘿卜素合成途徑的一些關(guān)鍵酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，因此，對(duì)關(guān)鍵酶的改造和功能的研究，對(duì)于提高類胡蘿卜素的合成具有重要意義。在三孢布拉氏霉菌類胡蘿卜素合成代謝過程中，CarRA作為雙功能蛋白起著承上啟下的重要作用，影響著番茄紅素的環(huán)化，從而控制著番茄紅素和β-胡蘿卜素的合成，因此，提高番茄紅素或β-胡蘿卜素產(chǎn)量，可通過改變CarRA中兩個(gè)酶的酶活性來實(shí)現(xiàn)。研究表明，通過發(fā)酵過程中添加合適的環(huán)化酶抑制劑可阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化，但會(huì)影響后續(xù)的類胡蘿卜素的提取質(zhì)量[13]。而定點(diǎn)突變因突變率高、簡(jiǎn)單易行且可改變特定的氨基酸，被越來越多地應(yīng)用于研究酶的結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，Velayos等[7]證明通過定點(diǎn)突變卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)中CarRP(與CarRA為同功酶)N端的R結(jié)構(gòu)域的某些氨基酸，會(huì)單一破壞番茄紅素環(huán)化酶活性而積累番茄紅素。為進(jìn)一步探究番茄紅素環(huán)化酶氨基酸突變位點(diǎn)對(duì)三孢布拉氏霉菌產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，本研究通過predictprotein對(duì)CarRA R-domain突變位點(diǎn)掃描分析，從中篩選出了一系列對(duì)蛋白功能影響較大的突變位點(diǎn)，Y5、W50、D51、W60、W62、P75、E77、E78、R119、F144、Y155、G146、Y152、P155、W161、G165、P182、D190、G197、W199、F205、S206、E218、E219、F222、F223，并對(duì)其中的E78 K、E78 W、R119D和P216S進(jìn)行定點(diǎn)突變。研究表明，不同氨基酸位點(diǎn)的突變可使CarRA構(gòu)象發(fā)生不同的變化，從而使番茄紅素環(huán)化酶和八氫番茄紅素合成酶酶活性相應(yīng)改變，甚至失活。當(dāng)八氫番茄紅素合成酶活性改變時(shí)，可能導(dǎo)致類胡蘿卜素的合成代謝受阻不能生成番茄紅素。而番茄紅素環(huán)化酶活性增強(qiáng)時(shí)，可使番茄紅素環(huán)化為β-胡蘿卜素，環(huán)化酶活性降低時(shí)，番茄紅素環(huán)化不徹底，可能使γ-胡蘿卜素積累，甚至導(dǎo)致番茄紅素大量積累。

除了改變特定的氨基酸位點(diǎn)，本研究又采用隨機(jī)突變方法來對(duì)番茄紅素環(huán)化酶進(jìn)行定向進(jìn)化研究，以便全方位地探究番茄紅素環(huán)化酶活性位點(diǎn)。定向進(jìn)化作為一項(xiàng)成熟的體外改造酶的技術(shù)，已得到日益廣泛的應(yīng)用，其中構(gòu)建突變文庫和高通量篩選是酶定向進(jìn)化不可或缺的組成部分。本研究通過隨機(jī)突變體庫的建立和突變體的篩選及突變位點(diǎn)的分析，以及菌落顏色的觀察和類胡蘿卜素產(chǎn)量的測(cè)定成功地表征了關(guān)鍵氨基酸對(duì)該酶活性的貢獻(xiàn)，并篩選出一系列影響番茄紅素環(huán)化酶功能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，結(jié)果表明，隨機(jī)突變對(duì)番茄紅素環(huán)化酶影響大的突變位點(diǎn)與上述predictprotein對(duì)突變位點(diǎn)的掃描結(jié)果大致相同，在突變體庫中E78 K、D51G、I149F突變等使番茄紅素環(huán)化酶活性降低，番茄紅素大量積累，菌落顏色為紅色，而W60R、F95 L突變等使番茄紅素環(huán)化酶活性增強(qiáng)而生成大量β-胡蘿卜素，菌落顏色為黃色。綜上所述，本文通過對(duì)番茄紅素環(huán)化酶進(jìn)行定點(diǎn)突變和利用易錯(cuò)PCR技術(shù)與依賴于酵母同源重組的隨機(jī)突變文庫實(shí)現(xiàn)了該酶的定向進(jìn)化研究，為高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)，具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。