枇杷葉HPLC特征圖譜研究及主要成分含量測定△

顧生玖，李鶴，，周艷林，鄒節(jié)明，林昆，陳鏡任，朱開梅*

1.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥葉，又名巴葉、蘆桔葉，具有清肺止咳，降逆止嘔的功效，主治肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等癥[1-3]。廣泛分布于我國大部分地區(qū)，全年均可采收。枇杷葉含有黃酮類、三萜酸類、倍半萜類、有機(jī)酸類及多糖類[4]等成分，目前對枇杷葉品質(zhì)的評價方法比較單一，通常以枇杷葉中三萜酸的含量作為評價指標(biāo)，缺乏整體性評價。文獻(xiàn)報道黃酮苷類成分具有較多的藥理活性[5-6]，且又是枇杷葉的主要成分，因此開展了枇杷葉藥材水溶性部位HPLC特征圖譜的研究，并對其中金絲桃苷和槲皮苷進(jìn)行含量測定，為枇杷葉藥材及其復(fù)方制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260系列高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機(jī)(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器(G-1329B)、智能化柱溫箱(G-1316A)、DAD檢測器(G-4212B)、Agilent1260 Infinity色譜工作站(美國安捷倫公司)；Milli-Q Direct 8超純水一體化系統(tǒng)(美國默克密理博公司)；XP404S型電子天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 試藥

綠原酸(批號：110753-201415，純度96.2%)、金絲桃苷(批號：111521-201004，純度98.0%)、異槲皮苷(批號：111809-201403，純度98.0%)、槲皮苷(批號：111538-201105，純度：98.0%)均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純(德國Merck公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純；MCI GEL CHP 20填料購自日本三菱化學(xué)公司。

實(shí)驗(yàn)用的新鮮枇杷葉采自廣西桂林，采集時間為2018年5月。采摘新葉(淡綠色且質(zhì)地較軟)300 g、成熟葉(綠色且質(zhì)地適中)300 g、老葉(墨綠色且質(zhì)地較硬)300 g、落葉(自然掉落的黃葉)300 g，自采藥材于60 ℃烘干，粉碎成粗粉。10批枇杷葉藥材購自于桂林中南藥業(yè)有限公司，經(jīng)鐘小清高級工程師鑒定為薔薇科常綠小喬木植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的葉，批號分別為160101(S1)、160501(S2)、160701(S3)、160901(S4)、161001(S5)、161101(S6)、161201(S7)、170101(S8)、170401(S9)、170501(S10)。

2 特征圖譜

2.1 色譜條件

采用資生堂CAPCELL PAK MG C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流動相梯度為：0～60 min，10%→20%A；60～84 min，20%→28% A；84～118 min，28%→48% A；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：355 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.36 mg、金絲桃苷0.03 mg、異槲皮苷0.02 mg、槲皮苷0.02 mg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取枇杷葉藥材粗粉2 g，加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL蒸干，殘渣加水10 mL使溶解；將其通過MCI GEL CHP 20柱(內(nèi)徑為1 cm，柱高為10 cm)，以50 mL水洗脫，棄去水洗液，用50%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加80%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰的保留時間和峰面積。以4號金絲桃苷峰為參照峰S，結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.17%，相對峰面積比值的RSD在0.2%～0.7%，均小于2.0%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液分別于制備后0、4、8、12、18、24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各共有峰的保留時間和峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.21%，相對峰面積比值的RSD在0.2%～0.9%，均小于2.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材(批號170101)分別制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各共有峰的保留時間和峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.22%，相對峰面積比值的RSD在0.9%～1.7%，均小于2.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 耐用性試驗(yàn)

2.3.4.1 不同色譜柱對測定的影響 分別取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，選用CAPCELL PAK MG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3根不同品牌的色譜柱，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，均能達(dá)到枇杷葉藥材特征圖譜的測定要求。

2.3.4.2 不同儀器對測定的影響 實(shí)驗(yàn)選擇安捷倫1260系列高效液相色譜儀、Waters e2695液相色譜儀和島津LC-20A液相色譜儀，取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液分別進(jìn)樣分析，結(jié)果3種儀器所得圖譜均符合測定要求，表明不同儀器對供試品色譜峰的影響不大。

2.4 特征圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

2.4.1 特征圖譜的建立 取10批及不同生長階段的枇杷葉藥材適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)》進(jìn)行分析、比較，經(jīng)多點(diǎn)校正和自動匹配后，生成對照特征圖譜。共標(biāo)定10個共有峰，選定這10個峰進(jìn)行峰匹配，建立枇杷葉藥材HPLC特佂圖譜。

4號峰為對照品金絲桃苷，出峰時間適宜，峰形較好，故選擇以金絲桃苷峰為參照峰S，其他9個色譜峰的相對保留時間分別為0.322 1、0.610 4、0.937 5、1.035 6、1.284 9、1.551 9、1.837 6、1.913 2和2.362 1，各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.39%，均小于2.0%，見圖1。

注：R.對照圖譜；S1～S10.批次。圖1 不同批次枇杷葉藥材的HPLC特征圖譜

通過對不同生長階段的枇杷葉藥材的測定，結(jié)合《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)》進(jìn)行分析。以4號峰為參照峰，其他9個色譜峰的相對保留時間分別為0.322 9、0.610 7、0.938 2、1.034 8、1.282 7、1.551 4、1.836 7、1.912 3和2.359 6，其共有峰相對保留時間的RSD在0.13%～0.87%，均小于2.0%，見圖2。

注：R.對照圖譜；S1.干葉；S2.新葉；S3.成熟葉；S4.老葉；S5.落葉。圖2 不同生長階段枇杷葉藥材的HPLC特征圖譜

2.4.2 各共有峰的指認(rèn) 取混合對照品溶液、枇杷葉藥材適量，按2.2項(xiàng)下方法制備，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，10批樣品特征圖譜的色譜峰均在118 min內(nèi)全部出完，對所得特征圖譜進(jìn)行指認(rèn)，選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性好以及特征明顯的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定了10個峰。其中1、4、5、6號峰分別為綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷，見圖3。

注：S1.空白溶液；S2.混合對照品；S3.供試品溶液；1.綠原酸；4.金絲桃苷；5.異槲皮苷；6.槲皮苷。圖3 枇杷葉供試品、混合對照品及空白溶液HPLC圖

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1 溶液的制備

3.1.1 混合對照品溶液制備 取金絲桃苷、槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷0.034 2 mg、槲皮苷0.028 6 mg的混合對照品溶液，即得。

3.1.2 供試品溶液的制備 同2.2.2。

3.2 色譜條件

色譜條件同2.1，在此條件下，各待測組分與相鄰峰之間的分離度均達(dá)到要求?？瞻兹芤涸谂c各待測組分相同保留時間處均未出現(xiàn)色譜峰(見圖4)。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取3.1.1項(xiàng)下的混合對照品溶液3、9、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：金絲桃苷Y=69.528X-0.881 8(r=0.999 7)；槲皮苷Y=57.908X-4.314(r=0.999 8)。結(jié)果表明，金絲桃苷和槲皮苷分別在0.102 6～0.855 0、0.085 8～0.715 0 μg呈良好的線性關(guān)系。

注：A.混合對照品；B.枇杷葉供試品；C.空白溶液；1.金絲桃苷；2.槲皮苷。圖4 枇杷葉及對照品的HPLC圖

3.3.2 精密度試驗(yàn) 取3.1.1項(xiàng)下對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD分別為1.40%、1.28%，表明該儀器精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD分別為0.58%、1.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行處理同一批次(批號170101)樣品6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測定，每次進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。結(jié)果金絲桃苷和槲皮苷含量的RSD分別為2.16%、2.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批枇杷葉(批號170101)粗粉1.0 g，共6份，分別加入與樣品中待測成分含有量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?，?.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計算平均加樣回收率。金絲桃苷和槲皮苷平均加樣回收率分別為99.76%、95.56%，RSD分別為4.88%、4.84%，結(jié)果表明該方法的回收率良好。

3.4 樣品測定

取不同批次及不同生長階段的枇杷葉藥材適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，平行測定3次，記錄峰面積，測定結(jié)果見表1～2。

表1 不同批次樣品測定結(jié)果 mg·g-1

表2 不同生長階段的枇杷葉測定結(jié)果 mg·g-1

由表1～2發(fā)現(xiàn)，枇杷葉中兩種黃酮類化合物的含量有一定的差異，說明其黃酮類成分因枇杷葉的生長環(huán)境、采集季節(jié)等而有所不同，其在不同生長階段的分布規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

4 討論

4.1 供試品處理方法的選擇

樣品在前處理過程中考察了加熱回流提取、超聲提取法及石油醚脫脂法[7-9]，結(jié)果回流提取法使有效成分提取較完全，先后考察了乙醇的體積分?jǐn)?shù)、用量、回流時間和回流次數(shù)的影響，結(jié)果方法確定為70%乙醇50 mL回流提取2 h。此外，還考察了柱色譜分離純化法，比較了大孔吸附樹脂D101型及MCI GEL CHP 20柱，因MCI GEL CHP 20柱洗去糖和其他水溶性成分，脫葉綠素效果好，且對皂苷類和黃酮類成分分離、純化效果較好。

4.2 流動相系統(tǒng)的選擇

為保證金絲桃苷和槲皮苷含量測定的準(zhǔn)確性，減少誤差，試驗(yàn)中分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液的流動相體系，結(jié)果表明，以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，基線波動較大，峰形不理想，而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相可以看出譜圖中特征峰出峰時間適宜，且峰形較好，分離度好，基線漂移小，因此選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相系統(tǒng)。