人參屬西洋參 人參和三七特征圖譜△

嚴華，張慧秀，白宗利，樂智勇，魏鋒*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.康美藥業(yè)股份有限公司，北京 102629

西洋參PanaxquinquefoliusL.、人參PanaxginsengC.A.Mey和三七PanaxnotoginsengF.H.Chen均為五加科人參屬的名貴中藥材，收載于歷版的《中華人民共和國藥典》，各有明確的功效[1]：西洋參補氣養(yǎng)陰、清熱生津；人參大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津、安神；三七散瘀止血、消腫定痛。近年來三者又陸續(xù)列入藥食同源的植物品種目錄，現(xiàn)已出現(xiàn)在糕點、糖、茶等食品中。人參在進入衛(wèi)生部新資源食品的同時有加以說明，必須為栽培5年以下的人工種植人參，而藥用人參通常參齡為5年以上[2-3]，西洋參、三七藥用種植規(guī)范規(guī)定，西洋參為栽培4年可采收[4]，三七栽培3年可采收。此外三七按采收時間分春三七和冬三七兩種規(guī)格，春三七通常10月份采收，此時采收的三七產(chǎn)量高、飽滿、質(zhì)量佳，冬三七為留籽后采收，飽滿程度及質(zhì)量不及前者[5]，由此，市場出現(xiàn)大量不足栽培年限的西洋參、人參、三七，影響了藥材的質(zhì)量。此外由于三者為同科同屬植物，有很多相同的成分，在價格波動情況下，常易發(fā)生替代或摻雜使用的現(xiàn)象[6]，尤其是加工成飲片后。為鑒別比較3種藥材，以及不同栽培年限的成分分布狀況，擬從成分上加以分析比較?，F(xiàn)行《中華人民共和國藥典》中3種藥材各自有成分相關(guān)的檢測方法，包括薄層鑒別及含量測定，但從提取方法到測定條件各不相同，在鑒定一個未知藥材，如藥材粉末時，需通過多次實驗，檢驗過程繁瑣。本研究通過采用地道的西洋參、人參及三七藥材建立適用于同時鑒別三者的HPLC特征圖譜，通過特征圖譜的比較、相似度及主成分分析，以及3種藥材共有皂苷成分峰面積的比值關(guān)系，達到了既可鑒別藥材品種，又可區(qū)分不同生長年限藥材的目的，方法專屬性強，分析時間比現(xiàn)行標準的HPLC含量測定方法時間縮短一倍，分離效果好。建議質(zhì)量標準在此3種同科同屬藥材的鑒別上采用統(tǒng)一的特征圖譜鑒別方法及含量測定方法，提高檢驗效率。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695-2996系列液相色譜儀(包括高精度四元梯度泵、真空在線脫氣機、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站等)；Alltech ES2000蒸發(fā)光散射檢測器；超聲波清洗儀(功率：250 W，頻率：40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

ChemPattern化學(xué)計量分析軟件[科邁恩(北京)科技有限公司]2.0版本，下文簡稱指紋圖譜軟件。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-201530，純度：92.4%)、人參皂苷Re對照品(批號：110754-201525，純度93.4%)、人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-201424，純度91.2%)、人參皂苷Rd對照品(批號：111818-201302，純度92.1%)、人參皂苷Rf對照品(批號：111719-201505，純度90.0%)、擬人參皂苷F11對照品(批號：110841-201607)、三七皂苷R1對照品(批號：110745-201820，純度93.1%)，西洋參對照藥材(批號：120997-201309)、人參對照藥材(批號：120917-201712)、三七對照藥材(批號：120941-201409)均由中國食品藥品檢定研究院提供；人參皂苷Rc對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：11021-14-0，純度>98%)；乙腈為色譜純(Fisher Chemical)；甲醇等試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限責(zé)任公司)；水為MILLI-Q去離子水(25 ℃，18 Ω，密理博公司)。

1.3 樣品

西洋參P.quinquefoliusL.總計115批樣品，其中栽培4年生的樣品73批，2年生、3年生樣品各21批；人參P.ginseng總計80批，其中5年生樣品20批，3～4年及6年生樣品各20批；三七P.notoginseng總計44批樣品，包括春三七、冬三七兩種規(guī)格，前者24批、后者20批，各樣品的產(chǎn)地信息詳見表1，由康美藥業(yè)股份有限公司種植基地及中國食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)本論文作者嚴華鑒定。樣品粉碎，過四號篩，分別測定水分，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd、Rf對照品、擬人參皂苷F11和三七皂苷R1，共10種對照品，分別加甲醇溶解，制成每1 mL含0.5 mg溶液作為對照品母液，再分別精密吸取各對照品母液2 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，靜置1 h，超聲提取30 min，放置至室溫，稱質(zhì)量，以甲醇補足減失的質(zhì)量，混勻，取通過微孔濾膜(0.45 μm)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Grace C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫：0～10 min，20%A；10～11 min，25%A；11～33 min，33%A；33～38 min，46%A；38～40 min，80%A；40～45 min，100%A；46 min，20%A；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，蒸發(fā)光散射儀溫度為110 ℃，氮氣流速為2.5 L·min-1，理論板數(shù)按人參皂苷Rb1計算應(yīng)不低于5000，進樣量10～20 μL。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 西洋參特征圖譜及與不同栽培年限品的比較 西洋參4年生樣品粉末73批，分別精密稱定，照2.2項供試品溶液制備方法制成西洋參供試品溶液，照2.3色譜條件注入液相色譜儀，記錄60 min HPLC圖，圖譜以AIA文件格式導(dǎo)入指紋圖譜分析軟件，以西洋參對照藥材為代表樣品，其他所有圖譜之比對，擬合成11個共有峰模式的特征圖譜，見圖1A疊加圖及圖2A特征圖譜，利用夾角余弦法計算特征圖譜的相似度，結(jié)果在0.86～0.99，相似性良好。2年生、3年生樣品圖譜與特征圖譜比較，相似度結(jié)果分別在0.56～0.90和0.81～0.96，2年生樣品圖譜相似度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可與4年生樣品顯著區(qū)分，3年生樣品圖譜與特征圖譜從相似度上不易區(qū)分。樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅰ～Ⅲ組樣品，圖譜見圖3。

注：R.混合對照品；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Re；4.人參皂苷Rf；5.人參皂苷Rb1；6.人參皂苷Rc；7.人參皂苷Rb2；8.人參皂苷Rb3；9.人參皂苷Rd；A.西洋參，由上至下為美國產(chǎn)、加拿大產(chǎn)、吉林集安產(chǎn)、遼寧丹東產(chǎn)、陜西留壩產(chǎn)；B.人參；C.三七。圖1 混合對照品及符合標準規(guī)定栽培年限西洋參、人參、三七HPLC圖

注：A.西洋參，1～11為特征峰；B.人參，1～9為特征峰；C.三七，1～10為特征峰。圖2 西洋參、人參、三七HPLC特征圖譜

圖3 不足栽培年限西洋參HPLC圖譜

表1 西洋參、人參、三七特征圖譜樣品信息及相似度、峰面積比值計算結(jié)果

2.4.2 人參特征圖譜及與不同栽培品的比較 取人參5年生樣品20批，分別精密稱定，同西洋參特征圖譜建立方法，以人參對照藥材為代表樣品，其他所有圖譜與之比對，擬合成9個共有峰模式的人參特征圖譜，見圖1B疊加圖及圖2B特征圖譜，相似度結(jié)果在0.86～0.99，相似性良好。4年生、6年生圖譜的相似度結(jié)果分別在0.89～0.97和0.88～0.98，從相似度不易區(qū)分；3年生相似度結(jié)果在0.43～0.92，與特征圖譜相似度差異較大，可與特征圖譜區(qū)分，樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅵ～Ⅶ組，圖譜見圖4。

注：由上至下依次為3年生、4年生、6年生人參圖4 3年生、4年生、6年生人參HPLC圖譜

2.4.3 三七特征圖譜及與冬三七的比較 取春三七樣品粉末24批，分別精密稱定，同西洋參特征圖譜建立方法，以三七對照藥材為代表樣品，其余樣品與之比對，擬合成10個特征峰的三七特征圖譜，見圖1C疊加圖及圖2C特征圖譜；相似度結(jié)果在0.96～1.00，圖譜相似性良好。冬三七圖譜與特征圖譜比較相似度結(jié)果分別在0.89～0.97相似度均不易區(qū)分。樣品信息及相似度結(jié)果詳見表1第Ⅷ～Ⅸ組，圖譜見圖5。

圖5 冬三七HPLC圖譜

2.4.4 特征峰的確認 樣品圖譜按峰面積占總峰面積2%積分處理，西洋參擬合成11個特征峰，經(jīng)與對照品色譜峰比對，并結(jié)合DAD光譜，確認人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc和人參皂苷Rd峰；同法對人參擬合，共有模式有9個特征峰，確認人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd峰；三七擬合成10個特征峰，確認三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd；可見三者的特征成分分別為人參皂苷Rc、人參皂苷Rf、三七皂苷R1，共有成分有4個，為人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 精密度 精密吸取同一批西洋參(批號：XYS-0401)供試品溶液20 μL，上述方法制備供試液，按色譜條件連續(xù)進樣測定6次，分別記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1.2%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，相似度評價結(jié)果為0.98，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性 精密吸取同一批西洋參(批號：XYS-0401)供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按2.3項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，計算相似度結(jié)果為0.99，表明西洋參供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。同法操作，取同一批次的人參(批號：RS0401)、三七(批號：SQ-051)供試品溶液，同法操作，結(jié)果人參和三七特征圖譜中各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，相似度分別為0.98和0.99，表明人參、三七供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.5.3 重復(fù)性 取同一批西洋參(批號：XYS-0401)樣品粉末6份，精密稱定，同時制備6份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液20 μL，上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以人參皂苷Rb1為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，計算相似度為0.95，表明該方法檢測西洋參時重復(fù)性良好。同法操作，分別取人參(批號：RS0401)、三七(批號：SQ-051)制備供試品溶液，注入液相色譜儀進樣測定，特征圖譜結(jié)果顯示，各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD均<2%，表明該方法檢測人參、三七時均具有良好的重復(fù)性。

2.5.4 西洋參不同栽培年限的比較 取2年生、3年生西洋參樣品照2.2項方法制備供試液，照2.3色譜條件記錄色譜圖，照2.4方法采用化學(xué)計量分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。相似度計算結(jié)果在0.56～0.90，與特征圖譜相似度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，主成分分析圖可見2年生樣品區(qū)域與特征圖譜區(qū)域不相交，可顯著區(qū)分從而達到鑒別的目的，但3年生樣品相似度在0.81～0.96，與特征圖譜較近似，主成分分析圖上可見3年生樣品介于2年生組與4年生組之間，區(qū)分不顯著，見圖3。

2.5.5 人參不同栽培年限的比較 取3年生、5年生、6年生人參樣品圖譜，采用化學(xué)計量分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，相似度計算結(jié)果分別在0.43～0.92、0.89～0.97、0.88～0.98，3年生樣品與特征圖譜相似度低，5年生、6年生與特征圖譜相似度高；主成分分析圖可見3年生樣品區(qū)域與特征圖譜區(qū)域相距遠，幾乎不相交，說明3年生人參與采收期的人參差別顯著，可達到區(qū)分鑒別的目的，5年生、6年生樣品與4年生樣品主成分分析結(jié)果聚在一起，未見顯著區(qū)別，見圖4，較符合現(xiàn)行的種植標準。

2.5.6 三七不同規(guī)格的比較 取冬三七樣品圖譜采用化學(xué)計量分析軟件數(shù)據(jù)處理，相似度計算結(jié)果在0.98～1.00，相似性高；主成分分析圖可見兩者主成分區(qū)域有相交處，但也有較明顯的差異，可聚在兩個不同的區(qū)域內(nèi)，見圖5。春三七是打去花蕾，在七月收獲的，體重色好，產(chǎn)量高，傳統(tǒng)上認為質(zhì)量佳，冬三七是結(jié)籽后起收的，體大質(zhì)松，除有計劃留籽外，傳統(tǒng)上不宜采收冬三七，可見兩者是有差異的。

2.5.7 西洋參、人參、三七的比較 本方法建立的西洋參、人參、三七特征圖譜相似度差異有統(tǒng)計學(xué)意義。西洋參特征峰為人參皂苷Rc，人參特征峰為人參皂苷Rf，三七特征峰為三七皂苷R1，此外其他峰的數(shù)量及峰面積差異顯著，若以西洋參特征圖譜為代表性樣品，相似度以1計，人參、三七的相似度分別在0.38～0.54、0.26～0.43，與西洋參相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可鑒別3種藥材；主成分分析顯示，三者各自聚在3個不相交的區(qū)域內(nèi)，見圖6；特征圖譜中人參皂苷Rg1、Re峰形因品種差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩者的峰面積的比值對于藥材的鑒定具有顯著意義，西洋參2～4年生該比值在0.03～0.64，即比值<0.7，人參3～6年生該比值在0.91～3.07，即Rg1峰面積>0.9，三七該比值在6.03～26.81，即Rg1峰面積遠高于Re峰面積，達6倍以上，詳見表1。

圖6 不同栽培年限西洋參主成分分析圖

圖7 不同栽培年限人參主成分分析圖

圖8 不同規(guī)格三七主成分分析圖

圖9 西洋參、人參、三七主成分分析圖

3 討論

3.1 樣品的選擇

西洋參、人參、三七藥材的產(chǎn)地、規(guī)格、品種繁多，復(fù)雜，建立特征圖譜的樣品均符合道地藥材、采收季節(jié)，且按現(xiàn)行標準檢測各項指標合格以保證特征圖譜的代表性、準確性。

3.2 提取方法的選擇

西洋參、人參、三七為同屬不同種植物，含有很多相近的成分，現(xiàn)行標準含量測定項下采用的樣品前處理方法各不相同，西洋參樣品前處理采用水飽和的正丁醇加熱回流1.5 h，蒸干濾液，以50%甲醇定容的方法。人參為樣品粉末置索氏提取器中，先以三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，揮干，再以水飽和的正丁醇浸泡過夜，超聲處理30 min，蒸干濾液，以甲醇定容的方法。三七采用樣品粉末加甲醇浸泡過夜，80 ℃水浴回流2 h的提取方法，各方法均非常繁瑣，為了比較3種藥材中成分分布狀況，必須建立相同的前處理方法，筆者研究了中國香港中藥材標準及美國、歐洲藥典標準，分別考察了以50%、80%、100%甲醇為溶劑，浸泡過夜超聲、浸泡2 h后超聲及浸泡2 h后回流的方法，結(jié)果采用適用于3種藥材的提取方法，即樣品粉末加甲醇，浸泡2 h，超聲提取30 min的方法，與原方法比較，縮短提取時間，更多地保留了成分信息，有利于為主成分分析提供更多數(shù)據(jù)，方法學(xué)驗證樣品溶液穩(wěn)定。

3.3 色譜柱的選擇

本研究采用C8色譜柱代替了現(xiàn)行標準采用的C18色譜柱，達到了更有效地多種難分離成分的目的[7]，如對同分異構(gòu)體人參皂苷Rb2和人參皂苷Rb3、人參皂苷Rf與擬人參皂苷F11的分離。擬人參皂苷F11為西洋參的一個特征成分，而人參皂苷Rf為人參的一個特征成分，雖然在紫外光(203 nm)下擬人參皂苷F11吸收弱，不影響人參皂苷Rf的檢測，但在蒸發(fā)光散射檢測擬人參皂苷F11時，以C18色譜柱檢測時易受人參皂苷Rf的干擾，不僅影響擬人參皂苷F11的含量測定，且易發(fā)生在西洋參中檢出人參皂苷Rf的風(fēng)險。

3.4 檢測方法的選擇

樣品測定過程中采用了液相色譜-紫外光-蒸發(fā)光散射(HPLC-UV-ELSD)聯(lián)用的檢測方法，以考察某些無紫外吸收的成分的特征圖譜狀況，如擬人參皂苷F11，結(jié)果ELSD檢測未發(fā)現(xiàn)各藥材的特有成分，而紫外檢測條件基線穩(wěn)定，更易操作，故選擇紫外光(203 nm)檢測條件下的特征圖譜進行樣品的分析研究。

3.5 流動相的選擇

為考察3種藥材中化學(xué)成分的分布，必須在同一色譜條件下進行分析，本研究在現(xiàn)行國內(nèi)外標準及文獻方法的基礎(chǔ)上，綜合考慮了西洋參、人參及三七3種藥材的多項成分，建立了特征圖譜色譜條件，采用乙腈-水替代標準方法中的磷酸溶液[8-9]，既有利于環(huán)保，又利于蒸發(fā)光散射器的安全使用，且較現(xiàn)行標準的色譜分析條件大幅度地縮短了測定時間，由標準方法的近2 h，縮短至1 h，良好分離了9種以上可確定的皂苷成分。

3.6 共有峰的確認

3種藥材除人參皂工Rg1、Re、Rb1、Rd外，人參皂苷Rb2、Rb3亦為三者共有，但二者在總皂苷中含量極低，主成分分析對三者鑒別以及不同栽培年限樣品比較的貢獻載荷均極小，故忽略未計。

4 小結(jié)

西洋參、人參和三七為同屬不同種植物，藥效確切，應(yīng)用廣泛，目前雖對皂苷、多糖、微量元素、礦物質(zhì)等類成分有廣泛的研究，但確切的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確，皂苷類成分入手對于不同產(chǎn)地、不同栽培年限確有明確的鑒別意義，故本研究采用已知成分為皂苷類成分為指標，建立了在相同的樣品前處理、色譜分析條件下的特征圖譜，分析比較了不同栽培期西洋參、人參、三七的成分差異，特有成分和共性成分，并從人參皂苷Rg1、Re的比值關(guān)系為三者的品種鑒別及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。