現(xiàn)代生物技術鑒定人參屬藥材的研究進展

查 琳，王 影，楊懷雷，徐芳菲，李 蕾，謝麗娟，郭暢冰，曹志強

（吉林人參研究院·吉林通化·134001）

五加科人參屬[1]Panax包括多種藥用植物，其中具有很高的藥用價值的有人參Panax ginseng、西洋參P.quinquefoliusm和三七P.notoginseng等。近年來，假冒偽劣人參屬中藥充斥市場，為控制其質量、保證臨床用藥安全和有效，需要對其進行嚴格鑒定。過去傳統(tǒng)的鑒定技術，主要是經(jīng)驗性的性狀鑒別，如通過眼觀、鼻聞、口嘗、手摸及升華、水火試等對藥物的形狀、大小、輕重、顏色、表面特征、折斷面紋理、氣味、粘性、酸堿性等進行鑒別和描述。這些方法雖然簡便、快速，但由于人們對人參屬藥材的藥用價值的迫切需要，應用現(xiàn)代生物技術對人參屬藥材鑒別具有重大的意義。

隨著科學手段的不斷進步，生物技術在各行各業(yè)得到廣泛應用，而且生物技術已經(jīng)在農業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領域首先取得了實質性成就。生物技術是一門應用生物科學研究成果以及工程手段增加數(shù)量和提高質量從而滿足人類日益增長的對生物制品需求的技術，它的具體內容包括細胞工程、發(fā)酵工程、酶和蛋白質工程、基因工程四個方面。生物技術的發(fā)展不僅為基因藥物帶來了福音，也使中藥的鑒別分析有了進一步發(fā)展。因此，對于鑒別人參屬藥材，現(xiàn)代生物技術也越來越趨于成熟。因此，本文通過現(xiàn)代生物技術中基因和蛋白質工程的角度闡述了對人參的鑒別方法的綜述及總結。

1 分子鑒定技術

1.1 DNA條形碼鑒定

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是通過比較一段通用DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應用前景[2]。陳士林等[3]在2010年提出ITS2作為藥用植物分子鑒定的通用序列。該鑒定技術只需少數(shù)基因片段，其過程快速，并具有較高的穩(wěn)定性和可重復性，操作簡單[4]。Chen等[5]將候選基因在753個屬4800個物種6600多個樣品中進行評估后，建議將ITS2作為藥用植物標準DNA條形碼pbsA-trnH可作為ITS2的互補序列對藥用植物進行鑒定在人參DNA形碼序列篩選研究中。Zuo等[6]從95份人參屬樣品中，比較了13條DNA barcoding的鑒定效率，最終得出該鑒定條形碼序列為pbsA-trnH和ITS。于2010年比較了11個候選DNA條形碼，在人參屬藥材上的應用推薦將ITS和psbA-trnH作為人參屬鑒定的條碼基因。羅志勇等[7]采用改良的CTAB法從人參，西洋參新鮮或干燥的根組織中提取得到了純度較高的DNA。Yao[8]系統(tǒng)論述了ITS2作為植物條形碼的鑒定的優(yōu)點，利用ITS2的的保守性設計通用引物，擴增成功率高，可以高效鑒別相近物種等。此方法的結果客觀準確，方法簡易，在人參類中藥材的鑒定上有明顯的優(yōu)勢，但單一的DNA條碼技術無法解決人參類中藥材鑒別的難題[9]。

1.2 DNA分子遺傳標記技術

1.2.1 限制性片斷長度多態(tài)性分析技術(RFLP)

如果兩種植物不同，其DNA分子則會有差別，經(jīng)限制性內切酶消化后所得的限制性酶譜的條帶方式將出現(xiàn)不同，即產生多態(tài)性。將藥材的DNA用限制性內切酶消化后，作RFLP分析，可確定其基因的種屬特異性。如馬小軍等[10]采用RFLP技術對5個人參類型進行了比較研究，找到了其DNA特征指紋差異。Ngan[11]等采用PCR-RFLP方法考察了5.8SrDNA ITS區(qū)，成功區(qū)分出人參屬6種植物及其2種易混偽品。羅志勇等[12]運用這一技術，成功地構建出高質量的人參、西洋參AFLP圖譜，發(fā)現(xiàn)北美西洋，參與引種到吉林的西洋參圖譜之間有一定差異，但小于人參與西洋參間的差異，說明引種的西洋參產生了一定的變異，但與人參的種間差異更為顯著。王雪松[13]等采用PCR-RFLP的鑒定方法提取西洋參與人參基因組DNA19kb，并擴增核糖體122bp大小的基因片段。經(jīng)酶切后西洋參為80bp和42bp長度兩條片段，而人參仍為122bp，西洋參與人參DNA具有特異性酶切位點，可作為兩者鑒定的有效方法。Diao Y[14]等應用PCR-RFLP對人參、西洋參及竹節(jié)參進行鑒別研究，成功地區(qū)分原藥材及其制劑，證明了該方法可以對參類進行區(qū)分。華愉教[15]等采用 DNA-AFLP技術對來自不同種源和地域太子參的基因表達差異進行分析，通過克隆測序后的序列對比揭示了太子參藥材品質形成的分子機。但這種技術的缺點是不易準確找到限制性內切酶位點，酶切位點也會隨著樣品DNA降解而丟失。

1.2.2 多聚酶鏈反應(PCR)測序技術

PCR是一種模擬自然DNA復制過程的體外酶促合成特異性核酸片斷技術。它以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物介導，通過DNA聚合酶促反應，在體外進行特異DNA序列擴增。PCR技術具有操作簡單、快速、特異、靈敏的特點。由于中藥材的加工和儲藏過程極不利于DNA的保存，而PCR技術能對微量或高度降解的樣品進行分析，故尤適用于干燥藥材鑒別。Fushimi等[16]采用PCR-RFLP方法對人參屬3種植物人參、西洋參和竹節(jié)參進行了核基因組18S-rRNA片段分析較易將其區(qū)別開來。

1.2.3 隨機引物PCR技術(RAPD)

PCR標記技術采用隨機引物對模板DNA進行擴增，或對引物進行簡單限定，該類標記技術可通過特異條帶法和聚類分析法來實現(xiàn)中藥材的鑒定。楊維澤等[17]發(fā)現(xiàn)人參屬植物人參、西洋參和三七中具有豐富的SSR重復基元，設計的人參屬SSR引物成功地擴增了三七的SSR引物，證明利用表達序列標簽分析(expressed sequence tag，EST)數(shù)據(jù)庫建立多態(tài)性ESTSSR標記是有效可行的。Shaw等[18]利用隨機擴增多態(tài)性DNA技術 (random am-plified polymorphic DNA)RAPD鑒定人參屬藥用植物人參、西洋參，三七，得出人參屬藥用植物與其混偽品的圖譜差異較大。Kwon[19]采用自AFLP標記轉化而來的物種特異SCAR標記技術(sequence characterized amplified region,SCAR)快速將三七從同屬其他物種中鑒別出來。陳子易等[20]通篩選特定的SSR引物并擴增出區(qū)分人參西洋參的特異性片段。丁建彌[21]等對人參子藥材進行RAPD鑒定研究，結果表明其真?zhèn)纹窋U增均能出現(xiàn)差異。日本東京大學Ozeki等[22]運用RAPD技術分析人參、高麗參及人參制品，實驗表明RAPD分析方法不僅可以鑒別人參與其他藥材，還可以鑒別人參制劑的中藥品種。王戎博[23]等開發(fā)了人參和西洋參之間的內含子長度多態(tài)性標記。分別設計了人參和西洋參的特異性引物，并建立了用于人參及西洋參鑒別的多重PCR體系。劉麗[24]等采用 RAPD標記法，結合PCR與聚類分析對三七、人參、西洋參進行了有效地鑒別。此方法存在一定不足，引物進行簡單限定進行擴增的方法要隨行實驗和比較，通用性差。因此，該類方法較難滿足良好的鑒定要求。由于RAPD是一種顯性標記技術，重復性和分辨率較低。

1.3 蛋白質指紋圖譜分子鑒定技術

蛋白質指紋圖譜是以特異性的蛋白質為檢測物質，利用電泳技術呈現(xiàn)出不同的蛋白質譜帶，從而將不同的檢測對象區(qū)分開來。趙皓[25]采用蛋白質指紋圖譜分子對兩種人參進行鑒別，鑒別準確率分別為76%和80%。王景[26]等利用單核苷酸多態(tài)性分子標記建立多重PCR體系，實現(xiàn)人參品種大馬牙的分子鑒定，建立了一種有效的田間純化技術手段。吳文如[27]等采用巢式 PCR-直接測序法分析人參中參與皂苷合成的關鍵酶，發(fā)現(xiàn)不同品種與產地人參的DS基因特異位點的SNP，為人參及其相關藥材的質量評價提供了遺傳依據(jù)。

1.4 其他

采用低cot值探針建立DNA指紋圖譜鑒定人參和西洋參[28,29]。崔光紅[30]應用多重等位基因特異性引物PCR在同一PCR反應中同時檢測人參、西洋參各自的SNP位點。達到準確鑒別人參、西洋參的目的。宋沁馨等[31]應用SNP測定結合芯片電泳法快速鑒別人參和西洋參。蔣超[32]等通過分析人參屬ITS，18S和matK序列，尋找特異性SNP位點設計引物，建立多重位點特異性PCR法，并對不同來源的人參、三七、西洋參樣品進行擴增，根據(jù)特異性條帶大小進行鑒別。

2 電泳技術

電泳技術是一種分離和鑒別混合物中帶電物質的技術，帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis，EP)?，F(xiàn)在已發(fā)展了SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印記轉移電泳，毛細管電泳等技術[33]。毛細管電泳是近幾年發(fā)展起來的一種重要分離技術,它在多肽、蛋白、核酸、手性化合物等生物活性物質的分離中顯示出廣闊的前景。高效毛細管電泳能減少電泳擴散，速度快，靈敏度高，分辨率強，在中藥中的應用集中在生物堿和黃酮及其苷類化合物[34]。閆正[35]采用毛細管區(qū)帶電泳法對人參進行了指紋圖譜研究，獲得了36個峰，并對人參的產地、種類進行區(qū)分。侯連兵等[36]采用高效毛細管電泳法對三七及其混淆品蛋白多肽進行分析，結果是三七及其混淆品蛋白多肽高效毛細管電泳譜圖有明顯的差異。

3 總結

近年來，從構建BAC文庫[37]對人參基因組進行探索，到二代高通量測序技術出現(xiàn)，現(xiàn)代生物技術的發(fā)展大大提高了測序的效率，降低了實驗成本，為人參屬藥用植物基因組的研究提供了良好的平臺，加快獲得人參屬藥用植物全基因組信息的進程。目前，以基因工程方法為主要技術手段的合成生物學[38,39]為實現(xiàn)人參皂苷的高效異源合成提供了一種可行的思路，且已成功應用于青蒿素[40～43]、紫杉醇[44,45]等重要天然產物的人工合成應用中。所以，生物技術作為高新技術產業(yè)具有非常長遠的發(fā)展前景，并且能夠為我們的生活帶來更多的改變。生物技術的發(fā)展正在不斷的促進經(jīng)濟的發(fā)展、科技的進步。把握好發(fā)展的方向，實現(xiàn)對生物技術的廣泛應用，不斷的推動人類文明的進步和發(fā)展。