LncRNA FTX 對(duì)慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞伊馬替尼抵抗的影響及機(jī)制研究△

王瑾，馬肖容，劉海玲，姚歡，張卉

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，西安 710000

慢性髓細(xì)胞性白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是慢性白血病中最常見(jiàn)的一種類型，患者早期多無(wú)臨床癥狀，常因白細(xì)胞增多或慢性脾臟腫大而就診。隨著臨床診療技術(shù)的發(fā)展，骨髓移植和靶向治療藥物在CML的治療中起重要作用。伊馬替尼（Imatinib）作為第一代靶向Bcr-Abl融合基因的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），其有效性和安全性均已被證實(shí)。然而，伊馬替尼耐藥是CML治療的一個(gè)主要問(wèn)題，嚴(yán)重影響了CML患者的臨床療效[1]。因此，明確伊馬替尼耐藥的形成機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)TKI臨床合理應(yīng)用具有重要意義。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，下調(diào)微小RNA（microRNA，miRNA）-451能夠有效改善CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥性，但其具體機(jī)制仍未完全闡明[2]。目前，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）被廣泛研究，其能夠影響編碼蛋白基因的上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄、抑制RNA聚合酶的活性、干擾mRNA的剪切等，從而發(fā)揮作用。LncRNA FTX屬于LncRNA，與肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展及耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[3-5]。因此，本研究對(duì)LncRNA FTX與人CML細(xì)胞伊馬替尼抵抗的關(guān)系及可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人CML細(xì)胞（K562）、人胚胎腎細(xì)胞（293T）均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，RPMI 1640、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，1%青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胰蛋白酶、陽(yáng)離子聚合物均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體 Lipofectamine?RNAiMAX Reagent、Nanodrop 2000c分光光度計(jì)均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，慢病毒包裝質(zhì)粒載體pLP-VSVG購(gòu)自美國(guó)Addgene質(zhì)粒保藏中心，RNA提取試劑RNAiso Reagent、SYBR Green核酸熒光染料和Trizol試劑均購(gòu)自日本Takara公司，無(wú)酶水購(gòu)自美國(guó)Invitrongen公司，多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白1（polypyrimidine tract-binding protein 1，PTBP1）一抗購(gòu)自美國(guó)Abacm公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購(gòu)自上海Roche公司。DM500光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡相機(jī)股份有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司，凝膠成像儀、逆轉(zhuǎn)錄PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將K562和293T細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，采用RPMI 1640或DMEM/F12培養(yǎng)基＋10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)貼壁細(xì)胞使用胰蛋白酶消化，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，按照1∶3的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代和培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 應(yīng)用間歇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)K562細(xì)胞對(duì)伊馬替尼產(chǎn)生耐藥，采用0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L的伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞進(jìn)行分步誘導(dǎo)。在每個(gè)濃度梯度下維持培養(yǎng)細(xì)胞2周以上，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，均在伊馬替尼濃度為4 μmol/L的培養(yǎng)基中篩選，直至細(xì)胞可維持生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1周后完成伊馬替尼抵抗組細(xì)胞的構(gòu)建，采用等體積生理鹽水處理CML細(xì)胞作為伊馬替尼敏感組。

通過(guò)10μlLipofectamine? RNAiMAX 轉(zhuǎn) 染pLP3-VSVG（每孔 0.45 μg）和 LncRNA FTX（每孔1.5 μg）于293T細(xì)胞中，48 h后收集病毒懸液，0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾懸液，擴(kuò)增質(zhì)粒用于后續(xù)使用。將收獲的慢病毒感染抵抗組細(xì)胞接種于6孔板，采用DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 ml病毒懸液培養(yǎng)，同時(shí)加入3 μl聚凝胺，連續(xù)感染2天，氨芐霉素篩選，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。抵抗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LncRNA FTX siRNA慢病毒作為轉(zhuǎn)染組，構(gòu)建伊馬替尼抵抗的LncRNA FTX細(xì)胞系，并將轉(zhuǎn)染空白載體的抵抗組細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)伊馬替尼的IC50值 接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待測(cè)的4組細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，以5000/孔細(xì)胞接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞貼壁完成后，棄上清，加入不同終濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的伊馬替尼稀釋溶液，處理48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃、5%CO2孵箱中孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度值。按照吸光度值繪制細(xì)胞生存曲線，計(jì)算細(xì)胞的半抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）和耐藥指數(shù)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量 將RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑PMSF混合后冰上裂解，離心提取，按照1∶5的比例加入上樣緩沖液煮沸。參考目的蛋白配制濃縮膠和分離膠，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次上樣，開(kāi)始電泳。選取20 μl目的蛋白先進(jìn)行β-actin抗體的電泳（一抗稀釋濃度為1∶400）。再進(jìn)行PTBP1抗體的孵育，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，TBSTw封閉液封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜，發(fā)光液曝光顯影，抗體稀釋濃度依據(jù)說(shuō)明書(shū)而定。分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA FTX和PTBP1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)4組細(xì)胞中LncRNA FTX的表達(dá)及轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞中PTBP1mRNA的表達(dá)水平。采用Trizol提取各組細(xì)胞中的總RNA，提取并檢測(cè)RNA純度。參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取后的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參，并進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中LncRNA FTX相對(duì)表達(dá)量的比較

抵抗組細(xì)胞中LncRNA FTX的相對(duì)表達(dá)量為（0.17±0.01），明顯高于敏感組的（0.03±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.746，P＜0.01）。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中LncRNA FTX的相對(duì)表達(dá)量為（0.03±0.01），明顯低于對(duì)照組的（0.18±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.318，P＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞伊馬替尼IC50值的比較

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，伊馬替尼對(duì)敏感組、抵抗組、對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50值分別為（1.410±0.096）、（7.060±0.635）、（7.282±0.839）和（3.704±0.285）μmol/L。伊馬替尼對(duì)抵抗組細(xì)胞的IC50值明顯高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.657，P＜0.01）；伊馬替尼對(duì)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.546，P＜0.01）。

2.3 敏感組與抵抗組細(xì)胞中PTBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，抵抗組細(xì)胞中PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.02±0.05），明顯高于敏感組的（0.52±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.547，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot 檢測(cè)敏感組和抵抗組細(xì)胞中PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.4 轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞中PTBP1蛋白與mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.59±0.02），明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的（1.37±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.855，P＜0.01）（圖2）。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞中PTBP1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（2.09±0.22）和（1.96±0.18），組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞中PTBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

CML主要見(jiàn)于中老年人群，發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，易被忽略，病情進(jìn)展后可出現(xiàn)巨脾、白細(xì)胞增多，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量較差，最終因病情急變而死亡[6]。自TKI藥物問(wèn)世以來(lái)，靶向治療因其高效、安全的特點(diǎn)已逐漸成為CML的一線治療方案。但在應(yīng)用TKI治療的過(guò)程中，部分CML患者會(huì)逐漸出現(xiàn)對(duì)靶向藥物耐藥的現(xiàn)象，從而影響其遠(yuǎn)期療效。目前，關(guān)于CML細(xì)胞耐藥的具體分子機(jī)制尚未完全明確，因此，對(duì)其進(jìn)行研究對(duì)CML的治療具有重要意義[7]。

Long等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FTX能夠靶向miRNA-29b-1-5p和Bcl2l2從而調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FTX可通過(guò)抑制miRNA-215的磷酸化從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FTX通過(guò)促進(jìn)有氧糖酵解和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表達(dá)從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡化。此外，LncRNA FTX在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平較高，并且能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)miRNA-342-3p的表達(dá)，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，敲低LncRNA FTX能夠抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且LncRNA FTX的表達(dá)情況對(duì)急性髓系白血病的耐藥性具有較大影響[12-13]；上述研究均表明LncRNA FTX與腫瘤的自身特性及其對(duì)藥物的耐藥性密切相關(guān)。PTBP1屬于異質(zhì)性核糖核蛋白家族中的一員，在RNA穩(wěn)定性、選擇性剪切和蛋白降解等方面均發(fā)揮作用[14-15]。有研究顯示，下調(diào)PTBP1的表達(dá)能夠有效調(diào)節(jié)耐藥性結(jié)腸癌細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，減少其對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-124/PTBP1/PKM2軸能夠通過(guò)Linc-ROR調(diào)控胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性。上述研究表明，PTBP1與LncRNA FTX均能夠明顯調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，且LncRNA FTX與PTBP1可能存在相互作用，推測(cè)LncRNA FTX可通過(guò)調(diào)節(jié)PTBP1的表達(dá)從而改變CML細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性。然而，目前關(guān)于PTBP1與CML關(guān)系的研究較少，且PTBP1與LncRNA FTX關(guān)系的研究尚未見(jiàn)。

本研究檢測(cè)了敏感組和抵抗組細(xì)胞中LncRNA FTX的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA FTX和PTBP1蛋白在抵抗組細(xì)胞中的表達(dá)均明顯上調(diào)，提示LncRNA FTX和PTBP1蛋白可能均與CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的抵抗有關(guān)，與Shinohara等[18]的研究結(jié)果一致。本研究將LncRNA FTX siRNA載體轉(zhuǎn)染至抵抗組細(xì)胞，外源性下調(diào)抵抗組細(xì)胞中LncRNA FTX的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼對(duì)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50值明顯降低，轉(zhuǎn)染組PTBP1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞中PTBP1mRNA的表達(dá)差異不大，提示LncRNA FTX可能通過(guò)下調(diào)PTBP1蛋白的表達(dá)從而降低其穩(wěn)定性或活性，進(jìn)一步影響CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性。

綜上所述，LncRNA FTX可能通過(guò)調(diào)節(jié)PTBP1蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)人CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥性。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討LncRNA FTX與PTBP1蛋白相互作用的具體方式，為臨床伊馬替尼耐藥性的逆轉(zhuǎn)、靶向藥物的設(shè)計(jì)以及多種藥物聯(lián)合化療的應(yīng)用提供一個(gè)新的思路。