HLA-G 在卵巢癌中的表達及對卵巢癌細胞生物學行為的影響

唐努爾·阿不力米提，帕提曼·米吉提，張璐，古扎麗努爾·阿布力孜

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦外科五科，烏魯木齊 830054

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前由于卵巢癌發(fā)病隱匿，又缺乏有效的早期診斷技術，導致卵巢癌患者病死率居高不下[1-3]。由于卵巢癌惡性程度高、早期易轉移，超過70%患者就診時均已處于晚期，導致手術后復發(fā)率高，5年生存率低[2,4-5]。因此探尋卵巢癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療方案和提高患者生活質已成為醫(yī)務工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。人類白細胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是機體內(nèi)一個重要的免疫耐受分子。HLA-G可通過與受體結合直接抑制多種免疫活性細胞的生物學功能，或通過誘導產(chǎn)生免疫調節(jié)細胞間接抑制機體的免疫應答。HLA-G在惡性腫瘤患者血漿中表達水平明顯升高，腫瘤細胞表達HLA-G被認為是其逃避宿主細胞免疫監(jiān)視策略的主要途徑[6-8]。研究顯示，HLA-G在卵巢癌及卵巢癌細胞中高表達[6,9-11]，但HLA-G在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制研究較少，本研究探討HLA-G在卵巢癌中的表達及對卵巢癌細胞生物學行為的影響，以期為臨床中及時篩查卵巢癌發(fā)揮重要作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2014年12月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的卵巢癌患者。所有患者術前均未進行放、化療及生物治療等。本研究共納入70例卵巢癌患者，≤50歲36例，＞50歲34例；病理類型：漿液性卵巢癌25例，黏液性卵巢癌17例，卵巢子宮內(nèi)膜樣癌15例，透明細胞癌13例；分化程度：高分化20例，中分化17例，低分化33例。按2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期[12]：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期20例，Ⅳ期18例；淋巴結轉移33例。收集卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織70例。另外，選取同期于新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院因子宮肌瘤行全子宮及雙附件手術治療的40例正常卵巢組織。所有標本均經(jīng)病理及影像學確診。

1.2 細胞、試劑及儀器

鼠抗人HLA-G單克隆抗體購自英國Serotec公司，ElivisionTM plus免疫組織化學試劑盒購自上海堃吉實業(yè)有限公司。卵巢癌SKOV-3細胞購自中國科學院上海細胞庫。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1 HLA-G真核表達載體及空白質粒pcDNA3.1購自廣州銳博生物技術有限公司；MK3酶標儀購自美國Thermo公司；Chemi-DocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 免疫組織化學法檢測及結果評價

采用免疫組織化學法檢測HLA-G的表達情況。取上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織切片后行常規(guī)脫水，于二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各浸泡10 min，置于枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復抗原。3%H2O2溶液中消除內(nèi)源性的過氧化物酶。一抗孵育4℃過夜，二抗37℃孵育。二氨基聯(lián)苯胺顯色，并用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢。

光鏡下觀察結果，在細胞膜上和細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒樣反應物為HLA-G陽性結果。每張切片隨機選擇10個視野，根據(jù)著色強度及范圍綜合評分。根據(jù)著色強度進行評分：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。根據(jù)陽性細胞所占比例進行評分：＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。著色強度與陽性細胞所占比例得分之積≥3分為陽性，0～2分為陰性。所有標本均經(jīng)一位病理副主任醫(yī)師診斷和一位病理主任醫(yī)師審核。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉染

將SKOV-3細胞接種于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當SKOV-3細胞融合度達到50%時候，利用LipofectamineTM3000脂質體將pcDNA3.1 HLA-G真核表達載體及空白質粒pcDNA3.1轉染到SKOV-3細胞中，分別記為過表達組和對照組，同時設立不轉染任何物質的空白組，6 h后換液。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）

采用Western blot法檢測過表達組、對照組和空白組細胞的HLA-G表達。裂解液提取3組細胞的總蛋白，參照標準裂解蛋白曲線來測定蛋白的濃度。取3組變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜后2%牛血清白蛋白室溫下孵育1 h。加入鼠抗人HLA-G單克隆抗體4℃過夜，加入二抗工作液，室溫下?lián)u床中孵育2 h后，加入堿性磷酸酶顯色劑20 min。掃描儀掃描條帶的灰度，自動圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，以空白組細胞蛋白的光密度值為參考標準1，過表達組和對照組細胞中目的蛋白與空白組細胞蛋白光密度值比值作為各蛋白的相對表達量。

1.6 MTT 法檢測細胞活力

將過表達組、對照組和空白組細胞接種到96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入MTT孵育4 h，舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結晶物溶解，于酶標儀上測定OD560nm值。

1.7 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

將Transwell小室放入6孔板中，將過表達組、對照組和空白組細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液接種于Transwell小室上，6孔板中不接種細胞加入10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，將小室取出來，多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色，最后在倒置顯微鏡下觀察并取5個視野中的細胞進行計數(shù)，取平均值。

將Transwell小室放入6孔板中，Matrigel膠平鋪于Transwell小室上，將過表達組、對照組和空白組細胞接種于平鋪Matrigel膠的Transwell小室上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入MTT孵育4 h，舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結晶物溶解，在倒置顯微鏡下觀察并取5個視野中的細胞進行計數(shù)，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HLA-G陽性表達率比較

上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達率為82.86%（58/70），明顯高于正常卵巢組織的10.00%（4/40），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=54.937，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G表達水平的比較

低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達率分別明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。不同年齡和病理類型的卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G表達水平的比較

2.3 HLA-G蛋白相對表達量的比較

過表達組細胞的HLA-G蛋白相對表達量為（2.48±0.25），明顯高于對照組和空白組細胞的（0.88±0.09）和（0.89±0.09），差異有統(tǒng)計學意義（F=323.266，P＜0.01）。

2.4 細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目的比較

過表達組、對照組及空白組細胞的細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目的比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；過表達組細胞的細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯高于對照組和空白組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 3組細胞的細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目的比較（±s）

表2 3組細胞的細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.01；b與對照組比較，P＜0.01

組別 細胞活力 細胞遷移數(shù)目 細胞侵襲數(shù)目空白組對照組過表達組F值P值0.55±0.06 0.55±0.06 0.75±0.08a b 31.819 0.000 125.35±12.39 126.49±13.27 165.34±16.45a b 25.908 0.000 185.32±19.23 186.24±18.97 253.21±25.32a b 33.175 0.000

3 討論

HLA-G主要分布于胎盤滋養(yǎng)細胞、血管內(nèi)皮、角膜、胸腺等健康組織或細胞表面。目前，研究認為HLA-G與自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）及細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的抑制性受體結合，抑制NK及CTL細胞的殺傷作用；也可通過提高腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等細胞因子表達進而調控細胞免疫應答作用，從而使腫瘤細胞免受宿主免疫細胞的識別，從而逃逸抗腫瘤免疫反應[6,8]。自1998年在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了HLA-G的存在后，隨著研究的進展發(fā)現(xiàn)HLA-G在宮頸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等十幾種腫瘤組織中高表達[6,8]。Singer等[10]研究發(fā)現(xiàn)74例卵巢癌晚期患者中有45例患者中表達HLA-G抗原，進一步研究發(fā)現(xiàn)有45例患者腹腔積液、33例患者原發(fā)灶、59例患者實體轉移灶均檢測到HLA-G的表達。本研究免疫組化法結果顯示，上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達率明顯高于正常卵巢組織（P＜0.01），與以往研究一致結果[3,10]。低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達率分別高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的患者（P＜0.01），與卵巢癌患者的年齡及病理類型無關。Jung等[13]采用免疫組織化學法、Western blot及逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測了41例卵巢癌組織及8例正常卵巢組織中HLA-G的表達，研究表明晚期卵巢癌組織中HLAG蛋白相對表達量明顯高于正常卵巢組織及早期卵巢癌組織，而且HLA-G陽性患者具有較差的預后。Andersson等[14]研究表明HLA-G在轉移性腫瘤細胞中的表達量高于原發(fā)性腫瘤。從而說明HLA-G相對表達量越高的上皮性卵巢癌組織的惡性程度越高，并伴有轉移性，患者預后較差。

本研究進一步探討HLA-G對卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，通過脂質體轉染pcDNA3.1 HLA-G到SKOV-3細胞中記為過表達組，同時設立對照組和空白組細胞，通過Western blot結果表明過表達組細胞的HLA-G蛋白相對表達量明顯高于對照組和空白組細胞（P＜0.01），提示細胞轉染成功。進一步對3組細胞進行細胞活力、細胞遷移及侵襲能力的比較，結果表明過表達組細胞的細胞活力、細胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯高于對照組和空白組細胞（P＜0.01），表明HLA-G可促進卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的能力。

綜上所述，HLA-G在上皮性卵巢癌組織中高表達提示卵巢癌分化程度低、FIGO分期高及有淋巴結轉移，HLA-G的高表達能促進卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。