lncRNA ATB 在食管鱗狀細胞癌中的表達及對預后的影響

徐赟，郭錳，張成輝

南陽市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

食管癌為消化道惡性腫瘤，在中國發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，病死率居第4位[1]。食管鱗狀細胞癌為食管癌的常見亞型，多數(shù)的食管鱗狀細胞癌患者發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)晚期轉(zhuǎn)移，導致5年生存率極低[2-3]。因此若能及早了解患者預后情況，給予針對性的干預對降低死亡事件的發(fā)生具有重要意義。但目前缺少靈敏度、準確度均較高的生物學標志物評估預后情況。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組長度大于200 bp的RNA，在多種生物學過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。被轉(zhuǎn)化生長因子β活化長鏈非編碼RNA（long non coding RNA activated by transforming growth factor-β，LncRNA ATB）為lncRNA家族的一員，有報道指出，其在乳腺癌及結(jié)直腸癌中表達異常，并與患者預后關系密切[7-8]。但lncRNA ATB在食管鱗狀細胞癌中的表達情況及是否與患者預后存在聯(lián)系未見報道。因此本研究采用實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測食管鱗狀細胞癌患者中l(wèi)ncRNA ATB的相對表達量，分析其與患者預后的關系，以期為臨床評估食管鱗狀細胞癌患者預后提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年1月至2016年1月南陽市中心醫(yī)院收治的95例食管鱗狀細胞癌患者為研究對象。納入標準：①均經(jīng)病理活檢確診為食管鱗狀細胞癌；②均行手術(shù)切除；③均為初治，無家族遺傳史；④預期生存時間≥5個月。排除標準：①入組前接受放化療等及其他針對性治療；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并嚴重心肝腎功能不全；④術(shù)前合并感染性疾?。虎荽嬖谑中g(shù)禁忌證；⑥對治療藥物存在過敏反應；⑦伴有遠處轉(zhuǎn)移；⑧隨訪失聯(lián)。95例食管鱗狀細胞癌患者中男性67例，女性28例；平均年齡（63.72±7.04）歲；體重指數(shù)（22.04±3.42）kg/m2。取95例食管鱗狀細胞癌患者的食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織（距腫瘤＞1 cm）進行研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

采用qRT-PCR法檢測食管鱗狀細胞癌組織和癌旁細胞中l(wèi)ncRNA ATB的相對表達量，采用Trizol試劑提取食管鱗狀細胞癌組織和癌旁細胞中的總RNA，在20 μl體系中加入2 μg總RNA合成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix進行qRTPCR，以cDNA為模板，引物濃度為0.4 μmol/L，在15 μl體系中進行擴增。lncRNA ATB引物序列，上游：5'-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3'，下游：5'-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3'。以GAPDH為內(nèi)參，上游：5'-GCAAGAGCACAAGAGGAAGA-3'，下游：5'-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3'。PCR擴增參數(shù)：95℃ 10 min預變性；95℃ 15 s，70℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示lncRNA ATB的相對表達量。

1.3 隨訪

采用電話或門診的方式對患者進行隨訪，每月隨訪1次，隨訪時間為5～36個月，起始時間為2012年1月15日，截止時間為2019年1月20日。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，配對資料采用配對t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析lncRNA ATB評估患者預后的效能。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存情況。影響因素的分析采用Cox單因素及多因素回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA ATB 相對表達量的比較

食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB相對表達量為（9.23±2.50），明顯高于癌旁組織的（6.53±2.04），差異有統(tǒng)計學意義（t=8.837，P＜0.01）。

2.2 食管鱗狀細胞癌患者的生存情況及l(fā)ncRNA ATB 相對表達量

食管鱗狀細胞癌患者1年、2年、3年生存率分別為90.53%（86/95）、74.74%（71/95）、68.42%（65/95）。通過為期3年的隨訪，食管鱗狀細胞癌死亡患者lncRNA ATB相對表達量為（9.94±2.72），明顯高于生存患者的（7.69±2.03），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.025，P＜0.01）。

2.3 lncRNA ATB 相對表達量評估食管鱗狀細胞癌患者預后的效能

lncRNA ATB相對表達量評估食管鱗狀細胞癌患者預后的曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度、特異度、約登指數(shù)及最佳截斷值分別為0.853（95%CI：0.765～0.917）、75.00% 、87.30% 、0.623、9.34。（圖1）

圖1 lncRNAATB 相對表達量評估食管鱗狀細胞癌患者預后的ROC曲線

2.4 不同臨床特征的食管鱗狀細胞癌患者的食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達情況的比較

以lncRNA ATB評估食管鱗狀細胞癌患者預后的最佳截斷值9.34作為臨界點，將患者分為lncRNA ATB高表達組（lncRNA ATB≥9.34）及l(fā)ncRNA ATB低表達組（lncRNA ATB＜9.34）。不同性別、年齡、腫瘤位置的食管鱗狀細胞癌患者的食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的食管鱗狀細胞癌患者的食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=18.788、8.461、6.711、15.130，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的食管鱗狀細胞癌患者的食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB的表達情況（n=95）

2.5 不同lncRNA ATB 相對表達量患者生存情況的比較

33例lncRNA ATB≥9.34的食管鱗狀細胞癌患者1年、2年、3年累積生存率分別為75.76%、57.58%、51.52%，明顯低于62例lncRNA ATB＜9.34患者的98.38%、83.87%、75.80%，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=12.860、7.887、5.781，P＜0.05）。（圖2）

圖2 lncRNAATB≥9.34（n=33）及l(fā)ncRNAATB＜9.34（n=62）食管鱗狀細胞癌患者的生存曲線

2.6 食管鱗狀細胞癌患者生存情況的影響因素分析

將性別（男=1，女=0）、年齡（≥60歲=1，＜60歲=0）、腫瘤位置（中、下段=1，上段=0）、腫瘤直徑（≥5 cm=1，＜5 cm=0）、分化程度（低分化=1，中、高分化=0）、TNM分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、新輔助放化療（無=1，有=0）、lncRNA ATB（≥9.34=1，＜9.34=0）納入Cox單因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB可能與食管鱗狀細胞癌患者生存情況有關。進一步將TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB是食管鱗狀細胞癌患者生存情況的影響因素。（表2）

表2 食管鱗狀細胞癌患者生存情況的影響因素分析

3 討論

lncRNAATB定位于人類第14號染色體，長度為2246個核苷酸[9-10]。lncRNA ATB含有多個miRNA-200結(jié)合位點，可通過競爭性結(jié)合miRNA-200參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。已有研究證實，lncRNA ATB參與胃癌、胰腺癌及腎癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與患者臨床特征及預后關系密切[13-15]。但關于lncRNA ATB與食管鱗狀細胞癌患者預后的關系未見報道，因此本研究對其進行探討。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA ATB相對表達量明顯高于癌旁組織，提示lncRNA ATB可能與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生存在聯(lián)系。結(jié)合臨床特征發(fā)現(xiàn)lncRNA ATB表達情況與食管鱗狀細胞癌患者腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能有關，提示lncRNA ATB可能參與食管鱗狀細胞癌的發(fā)展。本研究對食管鱗狀細胞癌患者進行隨訪，了解患者預后情況，并比較不同預后患者的lncRNA ATB相對表達量，結(jié)果顯示，死亡患者lncRNA ATB相對表達量明顯高于生存患者，因此推斷l(xiāng)ncRNA ATB或許可作為評估食管鱗狀細胞癌患者預后的潛在生物標志物。為驗證推斷，本研究通過構(gòu)建ROC曲線對lncRNA ATB評估食管鱗狀細胞癌患者預后的價值進行分析，結(jié)果顯示lncRNA ATB評估患者預后的AUC為0.853，表明lncRNA ATB評估食管鱗狀細胞癌患者預后的效能較高。同時比較不同lncRNA ATB表達情況的食管鱗狀細胞癌患者的累積生存率發(fā)現(xiàn)，lncRNA ATB≥9.34的食管鱗狀細胞癌患者1年、2年、3年累積生存率明顯低于lncRNA ATB＜9.34的患者。上述結(jié)果提示lncRNA ATB可能與患者生存預后存在聯(lián)系，進而本研究采用Cox單因素及多因素分析對食管鱗狀細胞癌患者生存預后的影響因素進行分析，結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、新輔助放化療及l(fā)ncRNA ATB是食管鱗狀細胞癌患者生存預后的影響因素，lncRNA ATB相對表達量越高，食管鱗狀細胞癌患者的死亡風險越高。

綜上所述，食管鱗狀細胞癌患者lncRNA ATB相對表達量升高，與患者的預后關系密切，檢測lncRNA ATB相對表達量有助于早期評估患者預后情況。此外本研究還為食管鱗狀細胞癌的治療提供了新的靶點。本研究下一步將進行動物實驗，對lncRNA ATB具體作用靶點及機制進行探討。