金屬硫蛋白1M在非小細胞肺癌中的表達及其與患者預后的關系

徐振雷，張正衛(wèi)

肺癌是惡性程度很高的腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%，由于早期癥狀不明顯，約75%的NSCLC患者被確診時有局部轉移或遠處轉移[1-4]，預后不容樂觀，因此尋找新的診斷和治療標志物迫在眉睫。

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類相對分子量低(6 000～7 000 Da)、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白，之前有研究報道其與細胞的金屬的代謝有關，并且可以保護細胞免受親電性致癌物的攻擊[5]。越來越多的研究報道MT家族在包括腫瘤在內(nèi)的病理過程中起到重要調(diào)節(jié)作用，MT被許多研究團隊證明在肝癌中低表達[6]，金屬硫蛋白1M(metallothio-nein 1M，MT1M)屬于MT家族的一員，有報道MT1M抑制了肝癌的發(fā)生發(fā)展[7-9]，MT1M啟動子甲基化是乳腺癌和肝癌的生物標志物[10-11]，提示MT1M與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。但是MT1M在NSCLC中的表達及生物學效應尚不完全清楚，本研究采用免疫組織化學方法檢測MT1M在NSCLC組織中的表達并分析其與患者臨床病理參數(shù)及預后之間的關系，并且在體外細胞功能層面研究MT1M與腫瘤侵襲和遷移的關系。

1 資料與方法

1.1 資料 組織芯片購于上海芯超有限公司，包含144對NSCLC組織及對應癌旁組織的組織芯片以及完整的臨床病理資料，患者術前均未經(jīng)放射治療和化學治療。

1.2 主要儀器與試劑 GTVisionTM抗兔鼠通用型免疫組織化學試劑盒購自于上海研卉生物有限公司，鼠抗人MT1M抗體、GAPDH單抗、FLAG抗體和兔抗鼠二抗購自于美國西格瑪公司。人NSCLC細胞系A549、H520和H1650細胞株，過表達MT1M質粒為PCDH-Lenti-MT1M flag(lenti-MT1M)，2個敲減MT1M質粒為pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)購自于上海中科院研究所。Transwell侵襲和遷移試劑盒購自于美國康寧公司。

1.3 免疫組織化學檢測 將組織芯片放置于二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水合，在沸騰的檸檬酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH6.0)進行抗原修復15 min，冷卻至室溫。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將芯片浸入0.3%過氧化氫磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中10 min，然后在PBS中充分沖洗。將芯片與MT1M的一抗(1∶100稀釋)一起孵育4 ℃過夜。用PBS洗滌后，使用二抗在37 ℃孵育30 min，使用PBS代替一抗作為陰性對照，使用奧林巴斯顯微鏡和軟件成像系統(tǒng)捕獲芯片圖像。

1.4 免疫組織化學結果判定 將組織芯片在光鏡下觀察和評分[12]，同時進行病理圖像采集。MT1M主要定位在細胞質，綜合低倍鏡下染色強度和高倍鏡下陽性細胞百分比進行半定量測定，為了減少誤差，隨機選取5個視野進行判讀。染色強度評分標準：基本不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。陽性細胞數(shù)百分比評分標準：計數(shù)400個細胞，陽性細胞百分數(shù)<10%為0分；10%～40%為1分；41%～70%為2分；>70%為3分。兩者相加后若為0～2分為陰性；2～6分為陽性。結果由2名有資質的病理科醫(yī)師進行判讀，陰陽性判斷不一致時，以第3位病理科醫(yī)師的判讀結果為準。

1.5 穩(wěn)定表達細胞株的構建 在6孔板內(nèi)加入適量細胞，使細胞密度24 h后達到50%，使用10%培養(yǎng)基與病毒感染液1:1混合后培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，加入1∶2 000嘌呤霉素培養(yǎng)基，篩選出陽性細胞，細胞傳代至第三代，收集細胞用免疫印跡法檢測過表達和敲減效率。

1.6 Transwell實驗分析細胞遷移和侵襲 調(diào)整細胞密度至5×105/mL，取200 μL細胞株各約1×105左右的細胞懸勻后鋪在上層小室里，下層小室加600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，孵育24 h，吸去上層小室培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，用棉簽小心刮除小室上方的細胞，反面的細胞用PBS清洗后，用甲醇固定30 min，0.2%的結晶紫染色20 min，PBS清洗后，在高倍鏡下(×400)用光鏡拍照，每個小室取5個視野，重復3次，計算3次均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MT1M在NSCLC組織中的表達及其與患者臨床病理參數(shù)間的關系 通過檢測144對NSCLC組織及其癌旁組織中MT1M的表達，腫瘤組織中MT1M陽性率為20.14%，癌旁組織中MT1M陽性率為90.28%，腫瘤組織及其癌旁組織之間MT1M陽性表達率差異比較具有統(tǒng)計學意義(χ2=143.23，P<0.01)。腫瘤組織中MT1M表達低于對應癌旁組織。典型免疫組織化學結果見圖1。腫瘤組織中MT1M的表達與淋巴結轉移、TNM分期有關(χ2分別為18.66、12.73，P均<0.01)，而與性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度無關(χ2分別為0.001、1.91、0.10、1.80，P均>0.05)，見表1。

MT1M主要定位于細胞質中；A、B為癌旁組織中MT1M高表達；C、D為腫瘤組織中MT1M低表達圖1 MT1M在NSCLC組織及其癌旁組織中的表達

表1 MT1M表達與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關系

2.2 MT1M對NSCLC細胞遷移和侵襲能力的影響 通過免疫印跡法檢測NSCLC細胞系中MT1M的表達，A549細胞和H520細胞中MT1M表達較正常肺上皮細胞BEAS-2B低，而H1650細胞中MT1M表達高(F=91.21，P<0.01)，圖2A。選取A549細胞和H1650細胞用于細胞遷移和侵襲功能實驗，在A549細胞中穩(wěn)定過表達MT1M，在H1650細胞中穩(wěn)定敲減MT1M，采用免疫印跡法驗證不同穩(wěn)轉細胞株中MT1M的表達情況，結果見圖2B、圖2C。Transwell實驗分析細胞遷移和侵襲實驗結果見圖3，過表達MT1M后A549遷移和侵襲能力明顯降低(t分別為14.08、9.177，P均<0.001)，敲減MT1M(選擇敲減細胞株shMT1M-2)后H1650遷移和侵襲能力明顯增強(F分別為50.46、48.09，P均<0.001)。

2.3 NSCLC組織中MT1M的表達與患者預后間的關系 生存分析結果表明，對于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M陽性患者的總體生存期高于MT1M陰性患者(見圖4A～圖4C)，差異比較具有統(tǒng)計學意義(Log-Rank檢驗，χ2分別為21.19、10.13、6.10，P均<0.05)。此外，多因素Cox回歸分析顯示，NSCLC組織中MT1M的表達是NSCLC患者預后不良的獨立危險因素(P<0.001，見表2)。

A.采用免疫印跡法檢測正常上皮細胞BEAS-2B和NSCLC細胞系中MT1M的表達；B.在A549細胞中使用慢病毒(lentivirus)穩(wěn)定過表達MT1M，獲得過表達細胞株PCDH-Lenti-MT1M flag(Lenti-MT1M)；C.在H1650中使用shRNA敲減MT1M，獲得敲減細胞株pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)，選擇GAPDH作為內(nèi)參，**P<0.01，***P<0.001圖2 免疫印跡法檢測NSCLC細胞系中MT1M表達

A.過表達MT1M后A549細胞遷移和侵襲能力顯著降低；B.敲減MT1M后H1650細胞遷移和侵襲能力顯著增強圖3 Transwell實驗分析NSCLC細胞株A549和H1650的遷移和侵襲

MT1M陽性與MT1M陰性NSCLC患者比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS：無差異A.TNM Ⅰ期(48例)；B.TNM Ⅱ期(48例)；C.TNM Ⅲ期(45例)；D.TNM Ⅳ期(3例)圖4 NSCLC患者MT1M表達與預后關系的Kaplan-Meier生存曲線

表2 NSCLC患者預后因素的單因素和多因素方差分析

3 討論

以往有研究報道，MT1M在肝癌組織中低表達，并且可以誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移[7-8,13]，MT1M表達較低的肝癌患者術后復發(fā)率明顯升高，預后往往不容樂觀[9]，同時MT1M啟動子甲基化狀態(tài)可以作為肝癌血清診斷的標志物[11]，表明MT1M對肝癌的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。本研究結果顯示，MT1M在NSCLC組織中的表達明顯低于癌旁組織，表明其低表達可能導致NSCLC組織上皮過度增殖或突變，進而形成腫瘤。

通常腫瘤細胞發(fā)生轉移，首先要在原發(fā)灶侵襲基底膜，然后進入血管或淋巴結，進而發(fā)生遠處轉移，是否發(fā)生轉移對患者的預后影響十分重要[14-15]。MT1M與患者臨床病理參數(shù)相關性分析發(fā)現(xiàn)MT1M與NSCLC淋巴結轉移呈負相關，患者越趨于淋巴結轉移，組織中MT1M表達越低。體外細胞功能實驗顯示MT1M在NSCLC中可能具有抑制癌細胞遷移的功能。此外，生存分析結果顯示，對于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M陰性的NSCLC患者總體生存期較MT1M陽性患者明顯縮短，多因素方差分析顯示NSCLC組織中MT1M的低表達是患者總體生存率的獨立危險因素，提示MT1M在NSCLC中可以作為預后標志物，其低表達提示NSCLC患者預后不良。

本研究初步探討了MT1M可能具有抑制NSCLC細胞侵襲轉移的功能，其表達也可作為NSCLC患者潛在的預后標志物，但具體作用機制還需要進一步研究。