人CD147胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)與純化

吳 東，南 剛，李佳悅，劉芬玲，崔洪勇

CD147是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。CD147在正常組織及胚胎組織中低表達(dá)，在上皮來(lái)源的癌組織中高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)癌特異性的、新型廣譜的腫瘤標(biāo)志物[1]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是CD147最主要的功能之一[2]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，CD147能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。研究證實(shí)，CD147能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)樣運(yùn)動(dòng)形式和阿米巴樣運(yùn)動(dòng)形式的轉(zhuǎn)換[4-5]，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝和自噬[6-7]。此外，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面的CD147能夠作為骨髓內(nèi)皮細(xì)胞分泌的親環(huán)素(cyclophilin A，CyPA)的受體促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和歸巢[8]，胰腺癌細(xì)胞表達(dá)的CD147與CyPA結(jié)合能夠促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展[9]，但是CD147誘導(dǎo)MMPs分泌、調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未闡明，尤其是CD147胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(CD147 intracellular domain，CD147ICD)的生物學(xué)功能和分子機(jī)制鮮見報(bào)道。

CD147分子全長(zhǎng)269個(gè)氨基酸，N端21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，參與CD147分子的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，信號(hào)肽之后的185個(gè)氨基酸為胞外段，接下來(lái)的24個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由C端39個(gè)氨基酸構(gòu)成。CD147胞外段包含2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，N端為C2結(jié)構(gòu)域(2～101位氨基酸)，C端為I樣結(jié)構(gòu)域(107～205位氨基酸)，2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域之間由5個(gè)氨基酸連接。CD147跨膜區(qū)序列在人、小鼠和雞之間完全保守，提示跨膜區(qū)有重要生理功能。CD147ICD在種屬之間也高度保守，提示胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可能參與介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的傳遞[10]。本實(shí)驗(yàn)室先后解析了CD147胞外段2.0?晶體結(jié)構(gòu)[11]和CD147胞外段與CyPA相互作用的液相結(jié)構(gòu)[12]，但CD147ICD的互作分子及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知之甚少。本研究通過(guò)構(gòu)建CD147ICD重組質(zhì)粒并制備純化CD147ICD，為CD147ICD互作分子的鑒定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Premix PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DH5α、Origami B(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士羅氏公司；凝血酶購(gòu)自Solarbio公司；Ni-Sepharose FF預(yù)裝柱購(gòu)自美國(guó)GE公司；引物由華大基因合成；3 KD超濾管、10 KD超濾管購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；其他試劑均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以人cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CD147ICD片段(上游引物：5′-TGGGTACCATGAAGCGCCGGAAGCCCGAG-3′，下游引物：5′-CAGATATCTCAGGAAGAGTTCCTCTGGC-3′；反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)),經(jīng)KpnⅠ/EcoRⅤ雙酶切后連接入pET-32a(+)質(zhì)粒，將連接混合物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆后進(jìn)行測(cè)序分析。取10 ng重組質(zhì)粒pET-32a(+)/CD147ICD轉(zhuǎn)化Origami B(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆經(jīng)酶切鑒定后凍存保種。

1.3 蛋白的表達(dá)和純化 接種5 μL pET-32a(+)/CD147ICD/Origami B菌液至5 mL Amp+/Kan+/Tet+LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)接5 mL培養(yǎng)過(guò)夜的pET-32a(+)/CD147ICD/Origami B菌液至500 mL Amp+/Kan+/Tet+LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～7 h后(OD600=0.6)，加入500 μL 1 mol/L IPTG，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～5 h。6 000 r/min離心6 min 收集菌體，Ni-NTA A液重懸洗滌1次，-80 ℃凍存。室溫融解菌泥，加入8 mL含蛋白酶抑制劑的Ni-NTA A液，振蕩重懸。冰浴超聲裂解細(xì)胞，300 W，5 s/10 s，30 min。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清。采用快速蛋白液相色譜系統(tǒng)AKTA FPLC GE-048，Ni-Sepharose FF預(yù)裝柱進(jìn)行蛋白純化，流速1 mL/min，30 min梯度洗脫，洗脫峰用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)鑒定組分和純度。采用凝血酶20 ℃酶切過(guò)夜，經(jīng)10 KD超濾管去除凝血酶后，用3 KD超濾管換液并濃縮目的蛋白。采用SDS-PAGE鑒定CD147ICD蛋白純度。

2 結(jié)果

2.1 CD147ICD重組質(zhì)粒的DNA測(cè)序 提取pET-32a(+)/CD147ICD質(zhì)粒(圖1)，經(jīng)KpnⅠ/EcoRⅤ雙酶切后在100 bp DNA ladder上方可見較弱的CD147ICD基因片段，大小符合預(yù)期(圖2)；測(cè)序結(jié)果如圖3，經(jīng)序列比對(duì)，插入序列正確，無(wú)堿基突變和移碼突變，證明CD147ICD重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 瓊脂糖電泳鑒定pET-32a(+)/CD147ICD質(zhì)粒

圖2 酶切鑒定pET-32a(+)/CD147ICD質(zhì)粒

圖3 DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒

2.2 TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的表達(dá)和純化 經(jīng)ExPASy在線工具預(yù)測(cè)TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的分子量是20.93 KD。采用37 ℃，1 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2、3、4、5 h。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)組相比，IPTG誘導(dǎo)2 h后重組菌即可大量表達(dá)分子量約為20 KD的目的蛋白(圖4)。經(jīng)超聲破碎裂解，高速離心后取上清進(jìn)行Ni2+親和層析，純化得到重組TrxA-His6-CD147ICD蛋白。

圖4 SDS-PAGE鑒定TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的表達(dá)水平

2.3 酶切、純化CD147ICD蛋白 經(jīng)ExPASy在線工具預(yù)測(cè)，凝血酶酶切后CD147ICD融合蛋白的分子量是7.01 KD。采用凝血酶20 ℃酶切過(guò)夜后，經(jīng)10 KD超濾管去除凝血酶，用3 KD超濾管換液并濃縮CD147ICD蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化后的CD147ICD蛋白在預(yù)期分子量7 KD處可見特異性條帶，蛋白純度在95%以上(圖5)。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后的CD147ICD蛋白濃度，經(jīng)計(jì)算其蛋白濃度為0.74 mg/mL。

圖5 SDS-PAGE鑒定純化的CD147ICD蛋白

3 討論

腫瘤相關(guān)抗原CD147在肺癌、肝癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，靶向CD147的肝癌抗體藥物“利卡汀”已批準(zhǔn)上市，取得了良好的治療效果[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，CD147能夠負(fù)性調(diào)控NO/cGMP介導(dǎo)的細(xì)胞鈣內(nèi)流，促進(jìn)MMP2和MMP9的分泌和活化，繼而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，上述作用需要該分子胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)的完整性，其中缺失胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CD147對(duì)肝癌細(xì)胞MMPs分泌、侵襲的調(diào)控功能缺失[14]，提示CD147ICD在促進(jìn)MMPs分泌、調(diào)控腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。Hibino等[15]研究發(fā)現(xiàn)，S100A9能夠結(jié)合于黑色素瘤細(xì)胞表面的CD147，促進(jìn)CD147ICD募集TRAF2，進(jìn)而促進(jìn)Cdc42活化和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，但是CD147與其配體S100A9結(jié)合后是如何調(diào)控其胞內(nèi)段募集TRAF2的仍不清楚[16]。目前，針對(duì)CD147分子的研究主要集中于胞外段，CD147ICD參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制尚不明確，CD147ICD的互作分子鮮見報(bào)道。缺乏高純度的CD147ICD蛋白是制約CD147ICD互作分子鑒定及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的重要因素。本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)CD147ICD實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，制備純度較高的CD147ICD蛋白，為后續(xù)制備CD147ICD單抗或多抗、篩選CD147ICD互作分子、解析CD147ICD結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。

利用PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)為117 bp的CD147ICD基因，將其連接到pET-32a(+)，獲得pET-32a(+)/CD147ICD重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化Origami B(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，重組菌能夠表達(dá)20.93 KD的TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白，利用Ni-NTA親和層析法純化后，采用凝血酶酶切去除TrxA-His6標(biāo)簽，獲得純度約為95%的CD147ICD蛋白，蛋白濃度為0.74 mg/mL。