中性粒細胞胞外捕網(wǎng)、血小板和腫瘤的關(guān)系

許張軒， 李虹萱， 吳清云， 鄒小明

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，黑龍江 哈爾濱 150086

細胞核或線粒體來源的DNA外顯化之后，與組蛋白和顆粒蛋白酶[如中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和過氧化物酶(MPO)]結(jié)合形成中性粒細胞胞外捕網(wǎng)(NETs)。NETs有助于中性粒細胞捕獲和殺死病原體，如細菌、病毒和真菌。目前的研究[1-2]認為，在癌癥和自身免疫等無菌條件下，同樣可以形成NETs并導(dǎo)致靜脈血栓形成。最新的文獻顯示，血小板對NETs的形成與否有重要的影響[3-7]。本文將重點介紹在感染和無菌條件下，我們目前對血小板作為NETs形成調(diào)節(jié)因子的作用的認識。

1 促凝腫瘤微環(huán)境

由于腫瘤可誘導(dǎo)血小板活化，活化的血小板刺激腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中的正常細胞分泌大量的血栓因子，此時凝血系統(tǒng)被激活，因此癌癥患者出現(xiàn)靜脈血栓疾病的風(fēng)險大大增加[3-4]?；罨蟮难“宄舜龠M血栓因子生成，還能以多種方式促進腫瘤的進展[5-6]。血小板α-顆粒攜帶大量的生長因子，如PDGF、VEGF和TGF-β，這些因子在血小板活化后被釋放，在創(chuàng)傷條件下有助于損傷部位的創(chuàng)面愈合和組織再生。然而，在腫瘤微環(huán)境中，這些生長因子卻有利于腫瘤增殖、血管生成和侵襲能力增加，從而促進腫瘤的進展。此外，血小板還能通過不同的機制促進腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。例如血小板可以保護腫瘤細胞免受循環(huán)中的免疫識別和剪切力，有助于腫瘤細胞的黏附，幫助腫瘤細胞通過血管壁[8]。最新的文獻顯示，腫瘤細胞與血小板直接接觸，誘導(dǎo)的NF-κB依賴性信號路徑和血小板源性TGF-β產(chǎn)生協(xié)同作用，促進腫瘤細胞上皮—間充質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(EMT)[9]。EMT是侵襲能力的標志，是癌上皮細胞轉(zhuǎn)移到遠處器官的先決條件。

在生理條件下，為維持血管壁的完整性，血管內(nèi)凝血途徑不被激活。然而，腫瘤患者內(nèi)皮下血小板激活因子如組織因子(TF)和膠原蛋白的暴露，刺激腫瘤局部的血小板活化，引起血管通透性增加，從而啟動內(nèi)源性凝血途徑。同時，癌細胞也不斷產(chǎn)生和分泌促凝因子，刺激腫瘤微環(huán)境甚至全身系統(tǒng)的血小板活化和血栓形成。TF由腫瘤細胞分泌，并在腫瘤細胞表面表達，與腫瘤的進展和血栓形成密切相關(guān)。例如，腫瘤組織中TF的表達升高與胰腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[10]。腫瘤細胞還可以分泌含TF的微粒(MPS)[11]。這些微粒與癌癥患者的血栓前狀態(tài)有密切關(guān)系[12-16]。除TF外，惡性腫瘤細胞還能分泌一種癌促凝物(CP)，它能激活與TF無關(guān)的外源性凝血途徑[1]。在實體腫瘤和血液疾病中均能檢測到CP，但在健康組織中未見其表達。許多研究表明，惡性腫瘤的進展與CP在不同類型癌癥中的表達有關(guān)[1]。另外，腫瘤微環(huán)境中乙酰肝素酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，可進一步促進腫瘤的血栓形成[4]。乙酰肝素酶通過增強TF活性促進凝血[2]，MMP-2可與活化血小板中的β受體結(jié)合，促進血小板聚集[17-18]。腫瘤細胞中VEGF表達升高，可引起腫瘤血管通透性增加，導(dǎo)致上述血栓因子分泌升高。此外，VEGF作為天然免疫細胞(如中性粒細胞和單核細胞)的趨化劑，在腫瘤微環(huán)境中也有助于凝血[19]。傳統(tǒng)上認為，止血和炎癥是互不干涉的兩個過程，但最新的研究表明它們是密切相關(guān)的[20]。例如，中性粒細胞可導(dǎo)致免疫血栓形成，因此對血栓形成疾病有重要的影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NETs有激活血小板和促進深靜脈血栓形成(DVT)的作用[21-23]。

2 NETs

中性粒細胞占人類白細胞總量的60%～70%。中性粒細胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它通過吞噬微生物和分泌抗微生物肽，保護宿主免受致病菌的侵襲[24]。NETs可導(dǎo)致局部蛋白酶濃度增加，幫助中性粒細胞捕獲和殺死病原體，如細菌、病毒和真菌[25-29]。除了微生物或脂多糖(LPS)等物質(zhì)的刺激可產(chǎn)生NETs外，在血栓形成、癌癥和自身免疫等無菌條件下也可生成NETs[30-31]。從第1篇關(guān)于腫瘤誘導(dǎo)的NETs形成的研究發(fā)表之后[32]，越來越多的研究結(jié)果顯示，NETs和腫瘤是密切相關(guān)的。研究表明，癌癥小鼠中性粒細胞較健康供者中性粒細胞更易形成NETs，且癌癥小鼠中性粒細胞還與肺血栓形成有關(guān)。NETs還會在癌癥小鼠的外周循環(huán)中積累，引起全身炎癥反應(yīng)，并在原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤生長的器官中顯著降低其血管功能[33]。最近的一項研究表明，NETs的形成與癌癥相關(guān)的腎功能不全密切相關(guān)[34]。

不僅如此，NETs還與癌癥相關(guān)的血栓形成有關(guān)，未來或可以通過阻止NETs形成而預(yù)防癌癥患者血栓形成[35]。NETs具有激活和聚集血小板的能力，這可能是其含有較高的核酸和組蛋白的原因[23]。由于NETs可以與內(nèi)源性凝血途徑的誘導(dǎo)因子Ⅻ結(jié)合并激活，所以NETs是DVT過程中不可缺少的因素[25]。而炎癥和血栓形成之間的關(guān)系也可能與NETs有關(guān)。

盡管NETs有助于控制感染，但NETs的形成也會造成組織損傷[36]。胞外組蛋白在1987年已被證明可以介導(dǎo)組織損傷[37]，此后一直被認為是細胞毒性的主要誘導(dǎo)劑。組蛋白在膿毒癥小鼠內(nèi)皮功能障礙、器官衰竭和死亡中起重要作用[38]。體外實驗表明，組蛋白對內(nèi)皮細胞有直接損傷作用。最近發(fā)現(xiàn)，NETs不僅對內(nèi)皮細胞有細胞毒性，對肺上皮細胞也有毒性[36]。同樣的研究[37]表明，不僅組蛋白介導(dǎo)了NETs對內(nèi)皮細胞和上皮細胞的細胞毒性作用，NETs分泌的MPO也參與了這一過程。

NETs可由不同的機制形成，它既可以通過一種中性粒細胞溶解的自殺機制，也可以通過另一種機制使中性粒細胞存活并執(zhí)行其他免疫功能[39]。另外，NETs中已被證實存在核DNA和線粒體DNA[40-42]。這兩種機制的共同模式是線粒體DNA快速外顯化，中性粒細胞裂解并釋放其核DNA成分[43]。顯然，對于NETs形成的機制，還有很大的研究空間值得我們進一步探索。

3 感染或無菌條件下血小板對NETs形成的影響

如上所述，NETs是血小板活化和血栓形成的基本支架。同時，活化的血小板可以提供促進NETs形成的信號，并維持其自身活化狀態(tài)。當LPS濃度達到足夠水平時，LPS與血小板膜上的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，誘導(dǎo)中性粒細胞活化和NETs形成[44]。這一機制與“NETs形成是免疫系統(tǒng)控制感染的最后手段”的觀點相符，因為NETs的形成也會導(dǎo)致組織損傷[45]。除了LPS外，三酰脂肽(Pam3CSK4)也可誘導(dǎo)血小板促進NETs形成，Pam3CSK4作為TLR1和TLR2的激動劑，是模擬細菌LPS的?；被薣46]。類似地，針對病毒入侵，血小板和中性粒細胞也相互作用并促進NETs形成。 在一項活病毒感染小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，CD41(整合素αⅡb亞單位)與NETs形成有關(guān)。正常病毒感染小鼠體內(nèi)，血小板和中性粒細胞在肝臟脈管系統(tǒng)內(nèi)相互作用形成NETs。當對缺乏CD41的小鼠進行相同的處理(感染活病毒)時，肝臟中未觀察到血小板聚集，NETs也未形成[45]。

除了微生物刺激與TLRs相互作用的情況外，在無菌條件下血小板也可促進NETs的形成。在輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)小鼠模型中，輸血后導(dǎo)致小鼠死亡的主要原因是活化的血小板誘導(dǎo)NETs的形成[47]。在該模型中，NETs可能參與了肺內(nèi)皮細胞的損傷。此外，在TRALI患者的肺和血漿中也發(fā)現(xiàn)了NETs。在TRALI小鼠模型中，以阿司匹林或替羅非班(血小板—纖維蛋白原抑制劑)靶向抑制血小板激活，發(fā)現(xiàn)NETs的形成減少，肺損傷減輕。這些數(shù)據(jù)表明，由膠原、凝血酶或ADP等經(jīng)典激動劑激活的血小板可促進NETs的形成。

研究表明，凝血酶激活的血小板可誘導(dǎo)NETs形成[48]。P-選擇素敲除小鼠的凝血酶激活的血小板未形成NETs，表明血小板顆?；罨筢尫诺目扇苄越橘|(zhì)并不能有效地誘導(dǎo)NETs的形成。因此，血小板P-選擇素與P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)在中性粒細胞表面的相互作用是必不可少的前提條件。

在小鼠腎缺血-再灌注(I/R)損傷模型中，腎組織中有NETs形成[49]。用氯吡格雷(血小板抑制劑)治療小鼠后，可降低I/R誘導(dǎo)的小鼠NETs形成和組織損傷，這進一步顯示了血小板在NETs形成中的作用。

血小板依賴性NETs形成在急性肺損傷小鼠模型中也得到了證實[50]。在該肺損傷模型中，證實血小板依賴性NETs形成需要通過血小板趨化因子刺激中性粒細胞，并通過整合素β2進行信號傳導(dǎo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，血小板膜糖蛋白GpIb也與血小板依賴性NETs形成有關(guān)[45]。事實上，血管性血友病因子(vWF)被認為是血小板GpIb和中性粒細胞PSGL-1之間的橋梁，阻斷這三者之一即可阻止血小板誘導(dǎo)NETs的形成。

研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白1(HMGB1)可激活血小板，誘導(dǎo)中性粒細胞形成NETs[51-52]。HMGB1除了在血小板中儲存和釋放以外，其他類型的免疫細胞也可分泌HMGB1。但HMGB1缺乏的血小板在激活后則不能誘導(dǎo)NETs形成[53]。該研究認為，晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)與HMGB1結(jié)合，激活中性粒細胞促進NETs形成。有爭議的是，另一項研究提出，HMGB1通過與中性粒細胞上的TLR4相互作用誘導(dǎo)NETs形成[51]。此外，微生物刺激后從血小板釋放的β-防御素也可誘導(dǎo)NETs形成[54]。趨化因子CXCL4在體外[46]和體內(nèi)[50]均與NETs形成有關(guān)。有研究表明，利用短肽抑制CXCL4和CCL5異二聚化，可減少急性肺損傷模型小鼠的NETs形成[50]。

活化的血小板在腫瘤誘導(dǎo)的NETs形成中是否也有作用,這個問題值得進一步探討。然而，考慮到已經(jīng)證明經(jīng)典的血小板激動劑(例如凝血酶)可促進血小板依賴性NETs形成，這種情況并非不可能。另外，腫瘤可通過TF的表達升高和產(chǎn)生凝血酶等機制促進血小板過度活化。P-選擇蛋白和纖維蛋白原受體不僅參與了血小板誘導(dǎo)的NETs形成，并在促血栓性腫瘤微環(huán)境激活的血小板上表達升高。最近還提出了血小板活化腫瘤細胞促進NETs形成的另一種機制[54]。該研究表明，血小板是腫瘤來源的外泌體的載體，進而促進NETs形成。

血小板TLR4在LPS誘導(dǎo)的NETs形成中起著重要的調(diào)節(jié)作用[44]。這可能是LPS以外的其他因素通過血小板TLR4信號途徑誘導(dǎo)NETs形成。有研究提出，可能是一種纖連蛋白的剪接變體—額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)，與血小板上的TLR4結(jié)合[55]，誘導(dǎo)NETs形成。有趣的是，血小板上ED-A與TLR4的結(jié)合與血小板聚集和動脈血栓形成有關(guān)[56]，但這種相互作用與NETs形成的機制之間的關(guān)系仍有待研究。

綜上所述，越來越多的證據(jù)表明，血小板在NETs的形成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。這對于人體來說可能是一個重要的調(diào)節(jié)點，以確保在沒有必要的情況下，對組織有細胞毒性的NETs不會形成。然而，在出現(xiàn)膿毒癥的情況下，形成NETs以消除感染可能仍是對人體最有利的選擇。 NETs也是腫瘤生長和其他炎癥反應(yīng)的結(jié)果，此時，NETs可能更多地作為細胞因子環(huán)境的不良反應(yīng)而對人體有害。因此，未來我們應(yīng)致力于了解哪些因素可誘導(dǎo)NETs形成，以便在負面影響超過正面的情況下干涉它們，從而使人體獲益最大。