FAP-α與VEGF 在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

段佳佳，王瑩

1應(yīng)急總醫(yī)院普外腫瘤科，北京 100028

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院病理科，北京 100020

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005—2014年，乳腺癌的發(fā)病率居全球女性腫瘤第1位，病死率居全球女性腫瘤第2位[1]。不同于其他實(shí)體腫瘤，乳腺癌具有異質(zhì)性，因而其治療方向逐漸從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腫瘤微環(huán)境。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，而成纖維細(xì)胞激活蛋白-α（fibroblast activation protein-α，F(xiàn)AP-α）是特異性表達(dá)于CAF表面的抗原分子，F(xiàn)AP-α具有促進(jìn)微血管生成的特性，可以參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性和血管生成等作用。目前，關(guān)于FAP-α、VEGF與乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的關(guān)系尚未見報(bào)道。因此，本研究對(duì)乳腺癌患者乳腺癌組織中FAP-α、VEGF的表達(dá)情況及相關(guān)性進(jìn)行分析，并探討了其與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年7月至2012年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院收治的乳腺癌患者。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌，且均有詳細(xì)的臨床資料、手術(shù)記錄，術(shù)前均未接受放療、化療等抗腫瘤治療。本研究共納入乳腺癌患者74例，患者的年齡為31～79歲，平均年齡為（51.8±11.5）歲；國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer，UICC）乳腺癌TNM分期[2]：Ⅰ期32例，ⅡA期28例，ⅡB期4例，ⅢA期10例；導(dǎo)管原位癌8例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌60例（1級(jí)4例，2級(jí)36例，3級(jí)20例），黏液癌2例，小葉癌2例，其他2例；腫瘤直徑為1.5～6.5 cm，中位腫瘤直徑為2 cm；T1c期42例，T2期30例，T3期2例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：1例患者于術(shù)后3年發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，1例患者于術(shù)后3年發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，1例患者于術(shù)后4年發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，1例患者于術(shù)后4年發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。收集74例乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本；同時(shí)，收集同期于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院行手術(shù)切除的20例乳腺纖維腺瘤和乳腺增生患者的乳腺組織為正常對(duì)照，其中乳腺纖維腺瘤組織10例，乳腺增生組織10例。

1.2 免疫組化染色法檢測(cè)不同組織中FAP-α、VEGF 蛋白的表達(dá)

收集乳腺癌組織標(biāo)本和正常乳腺組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定液固定乳腺組織，常規(guī)進(jìn)行乳腺組織取材、脫水、石蠟包埋制作石蠟包埋組織塊，切成4 μm石蠟切片，常規(guī)載玻片撈片。兔抗人FAP-α多克隆抗體（1∶50，購(gòu)自美國(guó)Vitatex公司）、兔抗人VEGF多克隆抗體（1∶100，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）均應(yīng)用生物素標(biāo)記的二抗及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色系統(tǒng)（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），行鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法染色，石蠟切片均需常規(guī)脫蠟，再經(jīng)梯度乙醇脫水，而后3%H2O2室溫滅活30 min，采用微波抗原修復(fù)，采用正常山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色、脫水、透明、封片。將已知的陽性切片作為陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色切片由2名高年資主治醫(yī)師采用雙盲方法判讀。FAP-α主要表達(dá)于乳腺癌間質(zhì)中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及腫瘤細(xì)胞中，呈淡黃色或棕黃色顆粒。VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。參照Henry等[3]的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)FAP-α和VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)：陰性，免疫組化染色陰性或＜1%的腫瘤細(xì)胞陽性；弱陽性，1%～10%的腫瘤細(xì)胞陽性；中度陽性，11%～50%的腫瘤細(xì)胞陽性；強(qiáng)陽性，＞50%的腫瘤細(xì)胞陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示；相關(guān)性分析采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAP-α蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

FAP-α蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1），但在正常乳腺組織的導(dǎo)管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果顯示，74例乳腺癌患者中，F(xiàn)AP-α蛋白陰性表達(dá)6例，弱陽性表達(dá)26例，中度陽性表達(dá)28例，強(qiáng)陽性表達(dá)14例。

圖1 乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 VEGF 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

VEGF蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖2），但在正常乳腺組織的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中不表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果顯示，74例乳腺癌患者中，VEGF陰性表達(dá)8例，弱陽性表達(dá)34例，中度陽性表達(dá)20例，強(qiáng)陽性表達(dá)12例。

圖2 乳腺癌組織中VEGF 蛋白的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.3 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者乳腺癌組織中VEGF與FAP-α的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.321，P＜0.05）。

2.4 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF 蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中VEGF蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌患者的T分期、N分期、臨床分期均呈正相關(guān)（P＜0.05）；乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌患者的N分期、臨床分期均呈正相關(guān)（P＜0.05）。（表1）

表1 乳腺癌組織中FAP-α、VEGF蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的相關(guān)性（n=74）

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)腫瘤之一，且病死率居高不下。相關(guān)研究表明，早期乳腺癌患者診斷時(shí)，已有約30%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而6%～10%的乳腺癌患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。DeSantis等[5]研究顯示，超過90%的乳腺癌患者的死亡不是由原發(fā)腫瘤本身導(dǎo)致的，而是由腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致。腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移均離不開腫瘤微環(huán)境，因此，針對(duì)乳腺癌微環(huán)境致癌機(jī)制的研究對(duì)乳腺癌的早期診斷和治療具有重要意義。

FAP-α是由Rettig等[6]于1986年首先報(bào)道的應(yīng)用單克隆抗體F19識(shí)別的一種膜抗原，屬于Ⅱ型絲氨酸蛋白酶類，基因定位于2q23[7]，分子量約為73 kD，具有分解明膠和Ⅰ型膠原的活性以及類似二肽基肽酶的活性；其可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與生物活性肽和趨化因子的裂解，從而使腫瘤細(xì)胞脫離原來的位置，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[6]。已有研究顯示，F(xiàn)AP-α具有膠原酶活性，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[8-11]。當(dāng)實(shí)體腫瘤（包括上皮來源的惡性腫瘤）的直徑大于1～2 mm時(shí)，需要通過微環(huán)境的基質(zhì)形成獲取腫瘤細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；而活化的成纖維細(xì)胞是這種起支持營(yíng)養(yǎng)作用的基質(zhì)成分所必需的。FAP-α是增生性成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志物，可能參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程，是腫瘤微環(huán)境中重要的活性產(chǎn)物之一。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但在正常乳腺組織的導(dǎo)管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)。Park等[12]和Shi等[13]研究均顯示，F(xiàn)AP-α無論在腫瘤細(xì)胞還是在間質(zhì)細(xì)胞中均可以表達(dá)。Liu等[14]研究顯示，F(xiàn)AP-α在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于間質(zhì)細(xì)胞。由于FAP-α可以同時(shí)表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，因而針對(duì)FAP-α的靶向治療也可以同時(shí)作用于腫瘤基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，該方法既可以抑制腫瘤細(xì)胞賴以生存的間質(zhì)，又可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究進(jìn)一步分析顯示：乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌患者的N分期呈正相關(guān)（P＜0.05）。Liu等[14]研究顯示，F(xiàn)AP-α表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Koperek等[15]研究結(jié)果顯示，在甲狀腺髓樣癌中，F(xiàn)AP-α的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示其可能是甲狀腺髓樣癌患者預(yù)后的相關(guān)因子，該研究結(jié)果與本文研究結(jié)果相似。還有研究表明，F(xiàn)AP-α高表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后差有關(guān)[13,16]，且FAP-αmRNA是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素[17]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP-α在女性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可以作為乳腺癌預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子[18]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中FAP-α蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床分期呈正相關(guān)（P＜0.05），提示臨床可以通過檢測(cè)FAP-α的表達(dá)情況，對(duì)部分高風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后差的乳腺癌患者進(jìn)行篩選，進(jìn)而盡早采取有效的預(yù)防及治療措施。

相關(guān)研究表明，F(xiàn)AP-α可能參與了腫瘤微血管的生成[19-20]。Cao 等[20]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AP-α可以激活細(xì)胞外基質(zhì)中的VEGF。Patsouras等[21]應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡和常規(guī)免疫組化法對(duì)胰腺癌中FAP-α和VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示FAP-α較VEGF可以更好地預(yù)測(cè)胰腺癌患者的預(yù)后情況。Li等[22]通過免疫組化法檢測(cè)了110例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者中VEGF的表達(dá)情況，結(jié)果顯示VEGF表達(dá)水平與乳腺癌患者的腫瘤直徑、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，提示VEGF與乳腺癌患者的疾病進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。Goussia等[23]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF高表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果還顯示，乳腺癌患者乳腺癌組織中VEGF與FAP-α的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05），乳腺癌組織中VEGF蛋白的表達(dá)水平與T分期、N分期及臨床分期均呈正相關(guān)（P＜0.05）。提示VEGF的表達(dá)水平越高，腫瘤微環(huán)境中血管生成活性越高，新血管生成越多，越有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，乳腺癌組織中FAP-α蛋白與VEGF蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，且這兩種蛋白與乳腺癌患者的N分期及臨床分期均呈正相關(guān)，可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。深入探究FAP-α、VEGF在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，可為臨床調(diào)控機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答及建立有效的治療策略提供新思路。